[发明专利]一种定标测定腺苷脱氨酶活性的方法及其配用的试剂盒和其用途

说明书

技术领域

本发明属于医学检验测定技术领域，具体涉及一种定标测定腺苷脱氨酶活性的方法及其配用的试剂盒和其用途。

背景技术

现有技术中用Trinder氏法定量测定腺苷脱氨酶活性在临床化学检验上较为普遍，但是，Trinder氏法缺点在于没能使用一种公认的标准法测定的腺苷脱氨酶标准品，从而造成测试精确度下降、不同实验室应用不同生化分析仪引起的仪器误差，此外还是腺苷脱氨酶正常参考范围数据混乱、不可比拟性的主要原因。

腺苷脱氨酶脱氢酶法应用腺苷脱氨酶解腺嘌呤核苷酸生成次黄嘌呤核苷和氨，氨和α-酮戊二酸以及还原性辅酶在谷氨酸脱脱氢酶的作用下反应生成谷氨酸及辅酶，在340nm处检测NADH的消耗速率来测定腺苷脱氨酶活性通过制定氨标准曲线，可定量腺苷脱氨酶活性，腺苷脱氨酶活性定义为在腺苷脱氨酶脱氢酶法条件下37℃每分钟产生一个μmol氨所需腺苷脱氨酶的量，其原理反应方程式如下：

但是腺苷脱氨酶脱氢酶法可定量测定腺苷脱氨酶活性，但此法易受外源性氨的干扰，不适于临床生化检验。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状，而提供一种在Trinder氏法中加入腺苷脱氨酶标准品，用腺苷脱氨酶脱氢酶法确定腺苷脱氨酶标准品的活性，再应用Trinder氏法以腺苷脱氨酶标准品的活性为参照，定量测定生物样本中腺苷脱氨酶活性，从而保证精确度高，测定速度快，且减少了仪器误差以及增强了腺苷脱氨酶正常参考范围数据的可比性的定标测定腺苷脱氨酶活性的方法。

本发明的另一个目的是提供用以实现定标测定腺苷脱氨酶活性的方法的配用的试剂盒。

本发明的第三个目的是用以实现定标测定腺苷脱氨酶活性的方法的配用的试剂盒的用途，以提供腺苷脱氨酶的活性测定用于急性肝损伤及残留病变的诊断以及协助慢性肝病及肝纤维化的诊断。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种定标测定腺苷脱氨酶活性的方法，其特征是：包括以下步骤：

步骤一是确定腺苷脱氨酶标准品的活性；

步骤二是再通过腺苷脱氨酶、嘌呤核苷酸化酶、黄嘌呤氧化酶及过氧化物酶酶解生成醌化合物；

步骤三是以连续监测醌化合物在546nm处吸光度的上升速率结合标准品的活性为参照，定量测定生物样本中腺苷脱氨酶的活性。

采取的措施还包括：

在上述的一种定标测定腺苷脱氨酶活性的方法中，所述的步骤一中具体操作为将腺苷脱氨酶样本与试剂RI同时加入，并孵育180秒，然后加入试剂RII，再孵育420秒加入试剂RIII，在340nm处定量测定吸光度，并用不同浓度氨代替底物腺苷，按上述方法在340nm处用测试仪定量测定吸光度，以此画出标准曲线，有腺苷脱氨酶标准品的吸光度从标准曲线上求出对应的氨浓度，并将其除以反应时间既得出腺苷脱氨酶标准品活性。

在上述的一种定标测定腺苷脱氨酶活性的方法中，所述的试剂RI包括0.015mol/L的a-酮戊二酸、0.30×10^-3mol/L的还原型辅酶I二钠盐、1.50×10^-3mol/L的腺嘌呤核苷二磷酸单钠盐以及0.10mol/L的且pH值为7.20的磷酸缓冲液，所述的试剂RII为200U/ml的谷氨酸脱脱氢酶，所述的试剂RIII包括1.20×10^-2mol/L的腺苷，2.00×10^-5mol/L的乙二胺四乙酸二钠，其中所述的试剂RII和试剂RIII均用pH7.20磷酸缓冲液配置。

在上述的一种定标测定腺苷脱氨酶活性的方法中，所述的腺苷脱氨酶样本为10μL，试剂I为200μL，试剂II为20μL，试剂III为50μL，腺苷脱氨酶样本与试剂I同时加入，在第180秒加入试剂II，在第420秒加入试剂III，且温度反应温度控制37℃。

在上述的一种定标测定腺苷脱氨酶活性的方法中，所述的波长的主波长为340nm，副波长为430nm。

在上述的一种定标测定腺苷脱氨酶活性的方法中，所述的步骤三中的计算按以下公式进行计算：

测试时间段每分钟平均吸光度的变化(ΔA/min)，