[发明专利]棘孢木霉及在合成(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇中的应用

权利要求书

1.棘孢木霉(Trichoderma asperellum)ZJPH0810，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，430072，保藏日期：2009年12月16日，保藏编号：CCTCC NO：M209307。

2.如权利要求1所述的棘孢木霉ZJPH0810，其特征在于所述棘孢木霉ZJPH0810菌株的真菌核糖体Internal Transcribed Spacer基因序列如下：

TCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGGTCACGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGAACCAACCAAACTCTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAAATTCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGATCGGCGTTGGGGATCGGGACCCCTCACACGGGTGCCGGCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACGTCCGTAAAACACCCAACTTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA。

3.如权利要求1所述的棘孢木霉ZJPH0810在微生物催化不对称合成(R)-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙醇中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述应用为：以棘孢木霉ZJPH0810培养获得的湿菌丝体为酶源，以1-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙酮为底物，在30℃，于pH 4.0～8.0的转化体系中进行转化反应10～45小时，反应液经分离纯化得到所述(R)-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙醇；所述转化反应在pH 5.7～8.0的磷酸盐缓冲液或pH4.0～6.0的磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲液中进行。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述转化体系中，底物[3，5-)双(三氟甲基)苯基]乙酮的初始浓度为10～150mmol/L，棘孢木霉ZJPH0810的湿菌丝体投入量以菌丝体干重计为35～70g/L。

6.如权利要求4或5所述的应用，其特征在于所述转化体系中还添加有辅助底物，所述辅助底物为下列之一：①葡萄糖、②蔗糖、③麦芽糖、④甘油、⑤甲醇、⑥乙醇、⑦正丁醇，辅助底物为葡萄糖、蔗糖或麦芽糖时，加入量为10～100g/L缓冲液，辅助底物为甲醇、乙醇或正丁醇时，加入体积为缓冲液体积的2～10％。

7.如权利要求4或5所述的应用，其特征在于所述湿菌丝体由如下方法制备得到：将棘孢木霉ZJPH0810接种至发酵培养基，30～35℃、180～240r/min振荡培养17～24小时，发酵液离心、洗涤沉淀，收集得到湿菌丝体；所述发酵培养基终浓度组成如下：葡萄糖20.0～25.0g/L，蛋白胨20.0～27.5g/L，(NH₄)₂SO₄ 3.0～4.0g/L，KH₂PO₄ 1.0～2.0g/L，MgSO₄ 0.5～1.25g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.008～0.02g/L，pH 4.0～7.5。

8.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述方法如下：

(1)将棘孢木霉ZJPH0810接种至发酵培养基，30℃、180～240r/min振荡培养21小时，发酵液离心、洗涤沉淀，收集得到湿菌丝体；所述发酵培养基终浓度组成如下：葡萄糖25g/L，蛋白胨27.5g/L，(NH₄)₂SO₄ 3g/L，KH₂PO₄ 1g/L，MgSO₄ 1.25g/L，ZnSO₄·7H₂O0.008g/L，pH 4.0～7.5；

(2)取20mM pH 5.7的磷酸缓冲液，加入步骤(1)所得湿菌丝体，湿菌丝体以干重计浓度为50g/L，加入底物1-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙酮至底物浓度为50mmol/L，并加入体积为缓冲液体积6.5％的乙醇作为辅助底物，30℃摇床振荡反应30小时，反应结束后将反应液离心，取上清液，加入等体积的乙酸乙酯萃取两次，得到(R)-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙醇。