[发明专利]水稻纹枯病菌融合群判定的鉴定方法

权利要求书

1.水稻纹枯病菌融合群判定的鉴定方法，其特征包括以下步骤：

1)隶属于不同菌丝融合群AG-1IA、AG-1IB、AG-2-1、AG-4、AG-5、AG-6、 AG-8和AG-BI的标准菌株，菌株代号分别为R1～R8，采用改良的CTAB法分别 提取其基因组总DNA；

2)设计能鉴别水稻纹枯病菌融合群类型的特异性引物：以步骤1)得到的 DNA为模板，以ITS1和ITS4为引物，分别进行各个标准菌株的ITS-5.8S rDNA 序列的PCR扩增，扩增后均得到700bp的目的条带，经序列测定后得到不同融 合群标准菌株的核苷酸序列，找到区分不同标准菌株的特异性碱基位点，设计 出鉴别不同融合群标准菌株ITS-5.8S rDNA序列的特异性鉴别引物，

ITS1核苷酸序列如SEQ No.1所示，

ITS4核苷酸序列如SEQ No.2所示，

菌丝融合群AG-1IA标准菌株R1的ITS-5.8S rDNA序列的特异性鉴别引物， 其核苷酸序列如SEQ No.3所示，

菌丝融合群AG-1IB标准菌株R2的ITS-5.8S rDNA序列的特异性鉴别引物， 其核苷酸序列如SEQ No.4所示，

菌丝融合群AG-2-1标准菌株R3的ITS-5.8S rDNA序列的特异性鉴别引物， 其核苷酸序列如SEQ No.5所示，

菌丝融合群AG-4标准菌株R4的ITS-5.8S rDNA序列的特异性鉴别引物， 其核苷酸序列如SEQ No.6所示，

菌丝融合群AG-5标准菌株R5的ITS-5.8S rDNA序列的特异性鉴别引物， 其核苷酸序列如SEQ No.7所示，

菌丝融合群AG-6标准菌株R6的ITS-5.8S rDNA序列的特异性鉴别引物， 其核苷酸序列如SEQ No.8所示，

菌丝融合群AG-8标准菌株R7的ITS-5.8S rDNA序列的特异性鉴别引物， 其核苷酸序列如SEQ No.9所示，

菌丝融合群AG-BI标准菌株R8的ITS-5.8S rDNA序列的特异性鉴别引物， 其核苷酸序列如SEQ No.10所示；

3)采集表现为水稻纹枯病症状的病株样本，从感病组织中分离、纯化水稻 纹枯病菌；

4)采用改良的CTAB法提取水稻纹枯病菌的基因组总DNA；

5)水稻纹枯病菌融合群判定的双重PCR鉴定：用步骤4)得到的水稻纹枯 病菌的DNA为PCR反应模板，以步骤2)得到的不同的融合群的特异性鉴别引物 作为水稻纹枯病菌融合群判定的特异性鉴别引物，同时加入通用引物ITS1和通 用引物ITS4，分别进行双重PCR，若能同时扩增出500bp和700bp的两条特异 性片段，即可判定该水稻纹枯病菌隶属于对应的菌丝融合群；若只能扩增出 700bp的片段，即判断水稻纹枯病菌不属于该菌丝融合群；

上述的改良的CTAB法步骤如下：取0.2g菌丝，液氮研磨后加入800μL DNA 提取液，65℃下水浴保温30min，10000g离心10min；取上清液用等体积的氯仿 /异戊醇抽提，10000g离心10min；用氯仿/异戊醇再抽提1次；上清液加入等 体积的DNA沉淀液，充分混匀，10000g离心10min；弃上清，在沉淀中加入1M NaCl 300μL，重新溶解，再加入等体积的氯仿/异戊醇抽提，10000g离心10min；取 上清液加入2.5倍体积的冷冻异丙醇，置于冰上30min沉淀DNA，4℃下10000g 离心10min，弃上清液，用70％的酒精清洗2次，抽干后加TE缓冲液充分溶解， 即得到菌株的基因组总DNA；

上述的DNA提取液为：1L溶液中含有20g CTAB、1.4M NaCl、100mM Tris-HCl、 20mM EDTA和1mlβ-巯基乙醇，pH值为8.0；

上述的DNA沉淀液为：1L溶液中含有10g CTAB、50mM Tris-HCl和10mM EDTA， pH值为8.0。