[发明专利]等电等电荷法提取动物血(猪血)中的SOD酶

说明书

技术领域

本发明涉及从猪血中提取SOD酶的处理方法。该方法根据血中主要蛋白质间等电点电荷存在较大差异特点而进行分离的一种方法。

背景技术

从动物血中制取SOD酶的技术早于1969后由Mccord和Fridovich第一次从动物血中所提取。这一技术是目前国内外从动物血中制取SOD酶的普遍做法。但这一技术所用试剂氯仿、丙酮具有刺激性强，不宜在较高温度下操作。本发明试剂可以在较高温度下进行，所用试剂或价格低廉，或用量少，或可以回收循环利用特点。完全可以取代Mccord法得到相应效果。

此一技术，原则上也适用于对各种生物具有已知等电点蛋白的分离。包括各种酶、蛋白类激素、各种细胞蛋白包括免疫球蛋白、以及各种特异性蛋白的分离等等。

对于SOD酶的分离，业界人士一般均认为较难提取，原因是分离时外界因素对其有一定影响：首先是温度，它在气候较高时则损害其活性；但却耐受较短时间的高温；其次是酸碱度，它的活力适合范围是PH：6-9。6以下越呈酸性，对活力影响越大。因而本发明充分考虑到这一特点相结合的一种分离方法。

发明内容

1、分离除去血浆

取新鲜猪血加入3.8％柠檬酸三钠抗凝剂，新鲜血液与抗凝剂之比为3∶1，搅拌均匀，以4000r/min离心10-15min，初步除去黄色血浆，收集红细胞。

红细胞中加放3倍体积的生理盐水，分三次，每次离心15min，继续除去黄色血浆及其悬浮物液。

2、红血球的破裂和血红细胞的渗出

加入同体积的去离子水，剧烈搅拌15min，在室温下迅速放入冰箱30min(≥-15℃)取出，在室温下剧烈搅拌15min，再放置冰箱30min(3℃-5℃)取出。

3、分离除去血红蛋白类杂质

(1)等电点电荷单宁沉淀法

a、NaH₂PO₄·2H₂O缓冲液(PH：5.5)的制备：将NaH₂SO₄·2H₂O-Na₂HPO₄·2H₂O配成0.2M浓度的溶液各1000ml，配成PH：5.5缓冲液备用。

b、血红蛋白的分离：将处理液用PH计测试(这时测得的数值大致为PH：6.5-6.9)，按处理液体积缓慢加入缓冲液(PH：5.5)，边加边拌，直到为PH：6±。搅拌30min，这时血红蛋白带正电荷，将单宁以每100毫升加入0.8-2g，血红蛋白被沉淀，以6000r/min离心弃除。

c、离子吸附法：测处理液的PH值继续保持PH：6，然后加入1/2体积的724弱酸性阳离子交换树脂，混合均匀，低温搅拌2-4小时，使其达到平衡。停止搅拌，取未被吸附的清液。

4、分离、弃去剩余杂质：

a、丁醇-K₂HPO₄·3H₂O的制备：将以上滤液按体积加入重量为38％的磷酸氢二钾(磷酸氢二钾先调成糊状)，充分搅拌15min，再加入体积15％的丁醇，搅拌均匀，置于3℃-5℃冰箱内，静置15min到1小时。

b、取出静置后，可以观察到溶液分4层：最上层为丁醇液，次上层为悬浮杂质层，次下层为磷酸氢二钾层，最下层为沉淀杂质层。

将此容器内容物用人造沸石过滤，滤除杂质以后6000r/min离心分离15min除沉淀物，再将上清液倒入分液漏斗内。这时可以见到内容物分上下层，上层为丁醇液(不含SOD)，下层为清液，取下层液于烧杯中。

(2)除去各种杂质——热沉淀

将以上溶液放入加热到68℃的水浴锅20min，取出在室温下迅速冷却，以滤纸过滤，除去沉淀物。

5、除去所用试剂残余量及弥补铜离子丢失：

a、将以上过滤后的溶液加入1.5倍体积的丁醇，搅拌后置于3℃-5℃冰箱内很快沉淀，经抽滤得白色沉淀物，b、沉淀物再用10倍体积的去离子水溶化，在每100ml中加入8％的氯化铜液1-2毫升。拌匀；c、再在此一溶液中重复用1.5倍丁醇沉淀抽滤，得白色稍带蓝色沉淀物，(丁醇可回收利用)。

6、真空冷冻干燥

取沉淀物进行真空冷冻干燥，此即为SOD粉剂。

具体实施方式