[发明专利]一种乙型肝炎病毒cccDNA双色荧光PCR检测方法及其试剂盒的应用

权利要求书

1.本发明为一种乙型肝炎病毒cccDNA(HBV cccDNA)双色荧光PCR检测方法及其试剂盒的应用，从外周血或者肝组织等样品中提取DNA，通过双色荧光定量PCR的方法对标本中的HBV cccDNA进行扩增，达到实时快速定量检测之目的。

2.根据权利要求1所述的一种HBV cccDNA双色荧光定量PCR检测方法及其试剂盒，特征在于试剂盒中同时引入了人3-磷酸甘油醛脱氢酶(H-GAPDH)基因作为参照基因，用于HBV cccDNA的检测试验过程的监控。该检测试剂盒的双色荧光PCR特异性引物序列和荧光探针标记如下：

(1)HBV cccDNA：

上游引物：5’-CGACCGACCTTGAGGCATAC-3’；

下游引物：5’-AGAGTAACTCCACAGAT/AGCTCC-3’；

荧光探针：FAM-5’CACCTCTGCCTAATCATCTCTTGTTC 3’-TAMRA；

(2)H-GAPDH：

上游引物：5’-AAGCGTTTTCTCCCTAAAGG-3’；

下游引物：5’-ACAAGCTTTGTACATGGTAT-3’；

荧光探针：VIC-5’CTGAGCTAGGCAGCAGCAAGCATTCC3’-TAMRA。

HBV cccDNA和H-GAPDH的荧光探针分别标记为FAM和VIC，所以称为双色荧光PCR检测方法，淬灭基团均为TAMRA。

3.根据权利要求1所述的双色荧光PCR检测方法及其试剂盒，该试剂盒组成成分包括核酸提取液、Taq酶系、HBV cccDNA双色荧光PCR MIX、经绝对定量的阳性质控品(1×10⁷copies/ml)和阴性质控品等。每个检测反应的PCR MIX由6ul 5×FQPCR buffer、各1ul上游引物(10uM)、各1ul下游引物(10uM)、各0.5ul荧光探针(10uM)、1uldNTPs(10mM)、12ulddH₂O组成。其中5×FQ PCR buffer由250mMTris-HCl(pH8.0)、25mM MgCl2、250mM KCl以及10％的DMSO等组成。

4.根据权利要求1所述的一种试剂盒其适用仪器和扩增条件为：ABI PRISM 7700、ABI PRISM5700、ABI GeneAmp 7000、ABI PRISM 7300/7500、MJ Opticon等荧光定量PCR仪扩增条件为93℃→2分钟，然后93℃30秒→55℃45秒(采集荧光信号)，40个循环；LightCycler等使用毛细管的仪器扩增条件为93℃→2分钟，然后93℃5秒→58℃45秒(检测荧光信号)，共40个循环。