[发明专利]一种乙型肝炎病毒cccDNA双色荧光PCR检测方法及其试剂盒的应用

说明书

一、技术领域

本试发明涉及乙型肝炎病毒cccDNA的检测方法，特别是涉及使用双色荧光定量PCR技术快速准确地检测出病人血液和肝组织中乙型肝炎病毒cccDNA的方法。本发明进一步涉及用于乙型肝炎病毒cccDNA检测的试剂盒。

二、背景技术

乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV，hepatitis B virus)感染引起的一种传染性疾病。据WHO相关统计，全世界无症状乙型肝炎病毒携带者超过2亿。而我国的乙肝病毒感染率约为60％；无症状乙肝病毒携带者约占总人口的7％，其中1/3出现肝损害的临床表现，目前我国有乙肝患者3000万。乙肝的发病特点为起病较缓，以亚临床型及慢性型乙型肝炎多见。本病主要通过血液、母婴和性接触进行传播。

乙型肝炎病毒(HBV，hepatitis B virus)属嗜肝DNA病毒科，病毒较小，基因组长约3.2kb，为部分双链环状DNA。基因组共有四个开放读码框(ORF)：(1)S基因区，由S基因、前S2基因、前S1(pre-S1)基因组成，分别编码HBsAg、pre-S、pre-S1等抗原以及多聚人血清白蛋白受体(PHSA-R)；(2)C基因区，由前C基因和C基因组成，分别编码HBeAg及HBcAg抗原；(3)P基因区，编码HBV-DNAp，并具有逆转录酶活性；(4)X基因区，编码HbxAg抗原，并具有激活HBcAg基因的作用。

乙型肝炎病毒HBV cccDNA即乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA(Covalentlyclosed circular DNA，cccDNA)是乙型肝炎病毒复制过程中最为关键的中间体形态，为HBV前基因组RNA的转录模板。在复制过程中，HBV基因组在聚合酶作用下将部分双链开环结构补足成完整双链结构，然后在细胞核内连接酶作用下把双链中缺口补平，形成共价闭合环状DNA结构，即HBV cccDNA。HBVcccDNA在细胞核内RNA聚合酶作用下，转录产生多种RNA，其中中间体RNA是形成子代HBV Dane颗粒的前体RNA，中间体RNA和病毒其它RNA分别在细胞浆内翻译产生HBsAg、HBeAg、HBcAg、HbxAg、DNA聚合酶等多种蛋白，进一步用于组装HBV。从复制过程来看HBV cccDNA是病毒复制以及致病机理的核心环节。

HBV cccDNA存在于肝细胞以及外周血淋巴细胞中。在肝细胞中HBVcccDNA可与细胞核内的核蛋白结合，形成稳定的微染色体结构。每个肝细胞内只有约5-50个拷贝的HBV cccDNA，对乙肝病毒的复制具有决定性意义。细胞内HBV cccDNA的维持有两个来源，一是肝细胞感染的HBVDane颗粒，二是在肝细胞内新形成的成熟核衣壳。目前临床使用的核昔类药物能有效抑制HBV病毒复制，但是对于HBV cccDNA效果却不佳。而临床上认为只有清除了细胞核内的cccDNA，才能彻底消除乙肝患者病毒携带状态，这也是抗病毒治疗的目标。据研究人体免疫性清除HBV cccDNA主要通过两种途径，一是通过非溶细胞途径，降低肝细胞内的cccDNA的量；二是通过增加清除已感染肝细胞的能力并启动肝细胞逆转来实现。所以临床上用以抗HBV的药物和正在研究的治疗乙肝的药物的应以清除HBV cccDNA为目的。但是目前尚没有高效、可靠、灵敏度高的药物和治疗方法可以供临床应用。

HBV cccDNA和细胞外乙型肝炎病毒松弛环状双链DNA(Relaxed circularDNA，RcDNA)分子有一些结构和功能的不同：首先，HBV cccDNA的两条链是完整的，闭合的，而且两条链呈共价互补，而松弛环状RcDNA在正链与负链上均有缺口或缺刻，只是部分区域互补故即使能形成环状结构也不是超螺旋结构；其次，HBV cccDNA则不能与蛋白质共价结合，而RcDNA能够与蛋白质共价结合；再者，由于缺口或缺刻的存在，RcDNA可以被一些核酸酶如外切核酸酶III等降解成寡核苷酸，而HBV cccDNA则由于是超螺旋结构且双链结构均是完整的，一般难以被降解。