[发明专利]脐带华通胶间充质干细胞的制备方法及其产品

说明书

技术领域

本发明涉及原始间充质干细胞的制备方法，尤其涉及以人脐带华通胶(Wharton’jelly)为材料制备间充质干细胞的方法及其产品。 

背景技术

当代细胞生物学研究表明，具有自我更新、多向分化潜能的间充质干细胞(MSCs)可以应用于多种疾病的治疗和康复。但是，在研究和应用中发现种子细胞存在种种问题，例如，胚胎干细胞的应用存在伦理道德、法律、免疫排斥及致肿瘤性等问题；自体骨髓单个核细胞存在成分复杂，具有多向分化潜能的干细胞含量低，分化潜能有限等问题；自体骨髓MSCs来源受限，细胞增殖分化潜能随年龄的增长而明显下降，体外长期扩增降低体内分化归巢潜能。 

与自体MSCs相比，脐血、脐带、胎盘MSCs来源充足、病毒污染概率低、免疫源性弱、细胞更为原始，无社会、伦理和法律方面的争议，但脐血源MSCs分离效率低，限制了其在细胞治疗和组织工程中的广泛应用；脐带、胎盘分离细胞纯度低，常混有血管内皮细胞临床不能应用。 

以上表明，当前尚无一种理想的种子细胞满足临床需求，需要扩展多能干细胞的来源。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一种材料来源易得，培养时间较短的间充质干细胞制备方法，按本发明方法制备的间充质干细胞具有更强的自我更新及多向分化潜能，而且易于冷冻保存。 

实现本发明目的的技术方案为，采用胎儿脐带的一种特殊组织——华通胶(Wharton胶)为原材料制备间充质干细胞，称为脐带华通胶间充质干细胞(Umbilical Cord Wharton’s Jelly-Derived MSCs，UW-MSCs)。UW-MSCs制 备方法为：取人新鲜脐带，以等渗平衡盐溶液或无血清培养基溶液洗去脐带残留血液，去除脐动脉、脐静脉及脐带外膜，提取华通胶并剪切成块，再以等渗平衡盐溶液或无血清DMEM培养基溶液(Dulbecco’s modification of Eagle’s mediumDulbecco)冲洗后，浸泡于0.05～0.3％胶原酶溶液中，置35～37.5℃温箱中10～30小时，组织块消化，液体呈粘稠状，然后加入相当于原液1～10倍量的含胎牛血清培养基终止消化，分装于培养瓶或培养皿，置CO₂培养箱，待细胞贴壁后更换含胎牛血清的培养基溶液，以后每隔2～4天换液一次，细胞贴壁融合后传代培养；传代培养2～4代，即时使用或冷冻保存备用。 

用以清洗脐带残血和用以冲洗华通胶组织块所用的等渗平衡盐溶液包括D-Hank平衡液、0.9％氯化钠溶液、磷酸盐缓冲液(PBS)。 

清洗脐带残血所用液体优选D-Hank平衡液；冲洗华通胶组织块所用液体优选无血清DMEM培养基溶液。 

作为优化，将清洗后的脐带剪切成长度为2～10cm的节段，进入下一工序。 

作为优化，将剥取出的脐带华通胶剪切成不大于2mm³的组织块，进入下一工序。 

作为优化，培养基中胎牛血清的浓度为5～30％。 

对于按本发明上述方法培养制备的干细胞，按照“国际细胞疗法协会”(ISCT)制订的标准进行生物学表型鉴定，表现出以下技术特征： 

①在标准培养条件下粘附于塑料制培养器皿成纤维样生长； 

②表达CD90、CD105、CD44、CD73，HLA-ABC；不表达CD45、CD34、CD80、CD86，HLA-DR； 

③体外可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞。 

脐带华通胶是位于脐带动脉、静脉与表皮之间的胶状间质组织，未见前人将其用于间充质干细胞的培养。上述鉴定结果表明本发明从脐带间质华通胶中分离的干细胞属于间充质干细胞，而不含造血干细胞。上述技术特征可以作为本发明方法所制得的间充质干细胞产品合格标准。 

按本发明方法制得的间充质干细胞(UW-MSCs)与骨髓来源的间充质干细胞(BMSCs)相比较，原代细胞培养时间从10-12天缩短为5-6天；按本发明方法制得的MSCs增殖能力、纯度均高于BMSCs；释放的生长因子、细胞因子量明显高于BMSCs，包括干细胞因子、粒细胞集落因子、肝细胞生长因子、转化生长因 子-β、白介素-8等，显示了更多的医药用途。 

鉴于本发明采用的是同种异体干细胞作为种子细胞来源，即异基因种子细胞。较之自体BMSCs，异基因种子细胞移植的关键问题是移植免疫学问题。为此本发明进行了系统的UW-MSCs体内外免疫源性鉴定。结果为：