[发明专利]热稳定的高温酸性α-淀粉酶基因、工程菌、重组酶及应用

权利要求书

1.一种热稳定高温酸性α-淀粉酶基因，其特征在于，它具有序列表中的SEQ ID NO.1所示的碱基序列。

2.一种热稳定高温酸性α-淀粉酶，其特征在于，它具有序列表中SEQ IDNO.1所示的碱基序列编码的蛋白序列。

3.一种碱基序列的表达载体，其特征在于，它是包括权利要求1所述的热稳定高温酸性α-淀粉酶基因的碱基序列的表达载体pEt-28a-His₆-amy。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，它由下列方法制得：将权利要求1所述的热稳定高温酸性α-淀粉酶基因的碱基序列扩增，与质粒pMD18-T载体连接，得到克隆载体pMD18-T-amy，再将克隆载体pMD18-T-amy和表达载体pEt-28a-His₆分别经EcoRI和SalI双酶切后连接得到表达载体pEt-28a-His₆-amy。

5.一种用于表达权利要求2所述的热稳定高温酸性α-淀粉酶的基因工程菌株大肠埃希氏菌EHJ21(Escherichia coli EHJ21)CGMCC No.2157，其特征在于，它是将权利要求3或4所述的表达载体pEt-28a-His₆-amy转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中得到的基因工程菌株大肠埃希氏菌EHJ21(Escherichia coli EHJ21)CGMCC No.2157。

6.一种用权利要求5所述的基因工程菌株大肠埃希氏菌EHJ21(Escherichia coli EHJ21)CGMCC No.2157产重组热稳定高温酸性α-淀粉酶的制备方法，其特征在于，其步骤如下，

(1)将基因工程菌株以1％的接种量接入装有50mL LB培养基的250mL三角瓶中，在37℃，180转/分下摇床培养，当培养菌液的OD₆₀₀达到1.0时，再加入浓度为1mmol·L^-1诱导剂IPTG，诱导4h，得发酵液；

(2)将发酵液13000×g离心5min后去掉上清，用3mL生理盐水悬浮细胞，13000×g离心5min去掉上清，重复此操作一次；用3mL蒸馏水充分悬浮细胞，0℃水浴中经超声波破碎5min，13000×g离心10min取上清液即得重组热稳定高温酸性α-淀粉酶的粗酶液；

(3)将制取的粗酶液用80℃水浴中处理30min，13000×g离心10min取上清液，再用DEAE离子交换层析和Ni亲和层析的方法对重组酶进行纯化，即得。

7.一种如权利要求6所述方法得到的重组热稳定高温酸性α-淀粉酶，其特征在于：该酶的分子量为50KD；适合作用温度90℃，在95℃和100℃分别有90％和70％的酶活力；该酶热稳定性不依赖于Ca²⁺，酶液分别在80、90、100℃保温5h后，其残余酶活分别为82％、77％和69％；该酶的作用pH范围为pH 4～9，适合作用pH为5.0～5.5，在pH 4.5有81％的残余酶活；在80℃和90℃下该酶在pH 5～9和pH 5～8的范围内稳定，该酶在100℃1h，pH 5～7.5的范围内稳定；金属离子K⁺、Na⁺对酶有激活作用，Hg²⁺、Pb²⁺、Al³⁺、Cu²⁺、Fe³⁺和Zn²⁺能够抑制酶活性；1mmmol·L^-1和5mmmol·L^-1N-溴代丁二酰亚胺对酶的活性具有抑制作用；该酶的Km为45mg·mL^-1，Vmax为9mg·ml^-1·min^-1；该酶分解马铃薯淀粉为麦芽糖和麦芽三糖。

8.一种如权利要求7所述重组热稳定高温酸性α-淀粉酶在淀粉水解中的应用。