[发明专利]热稳定的高温酸性α-淀粉酶基因、工程菌、重组酶及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域。涉及一种热稳定高温酸性α-淀粉酶及其基因和重组酶，包括热稳定高温酸性α-淀粉酶基因的表达载体；本发明还涉及其基因工程菌株大肠埃希氏菌EHJ21(Escherichia coli EHJ21)CGMCCNo.2157(已于2007年9月06日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.2157)；本发明还涉及该菌株产重组热稳定高温酸性α-淀粉酶方法与产品。

背景技术

α-淀粉酶为α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(α-1，4-glucan-4-glucanohydrolaseEC.3.2.1.1)，是最重要的工业酶制剂之一，已被广泛应用在食品、发酵、纺织、造纸和制药等诸多行业。目前工业用α-淀粉酶主要来自嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，这些酶的最适作用条件为90℃和pH 6，存在的主要问题是热稳定性差，高于100℃和pH低于6.0时易失活，热稳定性依赖Ca²⁺。超嗜热微生物由于能产生在高温下活性高，且具有很好热稳定性的超高温酶，而成为研究的热点。

超嗜热微生物处于特殊的物理、化学和生态环境，使它们形成了极为特殊的生物结构、代谢机制，导致来自超嗜热微生物的超高温酶具有独特的结构和功能，显示了其独特的特性：具有极高的热稳定性，通常能抵抗化学变性剂如表面活性剂、有机溶剂和高酸高碱环境，其催化功能优于目前在各种工业生产中应用的酶。因此，超高温酶已作为研究酶的进化、酶的稳定性和酶的活性机制、蛋白质结构和功能的关系以及生物催化性的模型。目前国外研究的超高温酶在分子生物学、淀粉加工、纤维素的降解、乙醇的生产及化学合成工业已有广泛的应用(Vieille et al.，2001)，已有高温聚合酶、糖酶、淀粉酶、蛋白酶等几种极端酶开始工业化生产，并且已经创造了数十亿美元的经济效益(肖湘等，2006)。

可以在80-110℃范围内生长的超高温菌，是α-淀粉酶最重要的潜在来源，国外已报道产高温α-淀粉酶的超嗜热微生物主要为乌兹炽热球菌(Pyrococcuswoesei)，强烈炽热球菌(P.furiosus)，热水高温球菌(Thermococcushydrothermalis)、Thermococcus profundus、Desulfurococcus mucosus、Pyrodictium abyssi、海生葡萄状嗜热菌(Staphylothermus marinus)、嗜热网络球杆菌(Dictyoglomus thermophilum)，海栖热袍菌(Thermotoga maritime)，其中来源于Pyrococcus woesei、Pyrococcus furiosus、Thermococcushydrothermalis、Thermococcus profundus和Thermotoga maritime等中α-淀粉酶基因已被克隆和表达到常温宿主细胞中。国内近几年开展了从超嗜热微生物中克隆α-淀粉酶基因的研究，如将强烈炽热球菌的α-淀粉酶基因在不同常温宿主中表达，以及海栖热袍菌的α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的表达的研究。

发明内容

本发明的目的之一是从嗜热古菌中克隆一种热稳定高温酸性α-淀粉酶的基因。

本发明的热稳定高温酸性α-淀粉酶基因来自超嗜热古菌嗜热球菌Thermococcus siculi HJ21菌株。本发明采用的技术方案是根据NCBI中已报道的超嗜热古菌α-淀粉酶的基因序列设计引物，通过聚合酶链式反应(PCR)的方法获得了超嗜热古菌嗜热球菌Thermococcus siculi HJ21α-淀粉酶基因的保守序列，采用SiteFinding-PCR技术扩增获得超嗜热古菌嗜热球菌Thermococcus siculi HJ21α-淀粉酶基因两端的序列。通过序列分析和拼接获得了1374bp完整的超嗜热古菌嗜热球菌Thermococcus siculi HJ21α-淀粉酶基因。测定了其碱基序列，如序列表SEQ ID NO.1所示：

本发明的另一目的是提供包括上述热稳定高温酸性α-淀粉酶基因碱基序列的表达载体。其是用常规方法将本发明的热稳定高温酸性α-淀粉酶基因的碱基序列连接于各种载体上构建而成，该载体可以是市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等。