[发明专利]通过包括热循环的多重置换扩增来扩增靶核酸序列的方法

权利要求书

1.扩增靶核酸序列的方法，该方法包括：

使一组引物、DNA聚合酶以及靶核酸序列在溶液中接触；和

温育该溶液以复制该靶核酸序列，

其中该靶核酸序列的复制产生复制链，并且在复制期间，所述复制链中的至少一条通过另一复制链的链置换复制而从该靶序列上置换下来，

其中所述温育时在两个温度范围之间进行热循环，其中一个温度范围是该DNA聚合酶的活性最适温度范围，另一个温度范围是促进所述引物与该靶序列杂交的温度范围。

2.权利要求1的方法，其中所述引物包括随机核苷酸序列或特定序列。

3.权利要求1的方法，其中所述引物具有约5至约20bp的长度。

4.权利要求1的方法，其中所述引物具有约5至约8bp的长度。

5.权利要求1的方法，其中所述引物具有约6bp的长度。

6.权利要求1的方法，其中该DNA聚合酶的最适温度高于杂交至该靶序列上的引物发生变性时的变性温度，并且低于在促进所述引物与该靶序列杂交的温度范围内进行温育期间复制链发生变性时的变性温度。

7.权利要求1的方法，其中该DNA聚合酶的最适温度范围为约40℃至约65℃。

8.权利要求1的方法，其中促进所述引物与该靶序列杂交的温度范围为约0℃至约35℃。

9.权利要求1的方法，其中该DNA聚合酶包括DNA聚合酶、TtsDNA聚合酶、M2DNA聚合酶、VENT^TM DNA聚合酶、T5DNA聚合酶、PRD1DNA聚合酶、或Bst DNA聚合酶。

10.权利要求1的方法，其中该DNA聚合酶包括外切(-)Bst DNA聚合酶，该DNA聚合酶的最适温度范围为约46℃至约75℃，并且促进所述引物与该靶序列杂交的温度范围为约4℃至约35℃。

11.权利要求10的方法，其中所述引物包括具有约6bp长度的随机引物或具有特定序列的引物。

12.权利要求11的方法，其中所述引物包括至少一种修饰的核苷酸，其中所述引物是耐核酸酶的。

13.权利要求12的方法，其中该修饰的核苷酸包括生物素化核苷酸、荧光标记核苷酸、5-甲基-dCTP、BrdUTP、或5-(3-氨基烯丙基)-2′-脱氧尿苷-5′-三磷酸。

14.扩增靶核酸序列的方法，该方法包括：

使一组引物、DNA聚合酶以及靶核酸序列在溶液中接触；和

温育该溶液以复制该靶核酸序列，

其中所述温育时在该DNA聚合酶的活性最适温度范围与另一温度范围之间进行热循环，所述另一温度范围是促进所述引物与该靶序列杂交的温度范围，

其中该DNA聚合酶的最适温度高于杂交至该靶序列上的引物发生变性时的变性温度，并且低于在促进所述引物与该靶序列杂交的温度范围内进行温育期间复制链发生变性时的变性温度。

15.权利要求14的方法，其中该靶核酸序列的复制产生复制链，并且在复制期间，所述复制链中的至少一条通过另一复制链的链置换复制而从该靶序列上置换下来。

16.扩增靶核酸序列的方法，该方法包括：

使一组引物、DNA聚合酶以及靶核酸序列在溶液中接触；和

温育该溶液以复制该靶核酸序列，

其中所述温育时，在该DNA聚合酶的活性最适温度范围与另一温度范围之间进行热循环，所述另一温度范围是促进所述引物与该靶序列杂交的温度范围，

其中该DNA聚合酶包括外切(-)Bst DNA聚合酶，该DNA聚合酶的最适温度范围为约46℃至约75℃，并且促进所述引物与该靶序列杂交的温度范围为约4℃至约35℃。

17.权利要求16的方法，其中该靶核酸序列的复制产生复制链，并且在复制期间，所述复制链中的至少一条通过另一复制链的链置换复制而从该靶序列上置换下来。