[发明专利]通过包括热循环的多重置换扩增来扩增靶核酸序列的方法

说明书

技术领域

本发明的示例性实施方式涉及通过多重置换扩增来扩增靶核酸序列的方法，更具体而言，涉及包括热循环的通过多重置换扩增来扩增靶核酸序列的方法。

背景技术

已知各种扩增核酸的方法。这些方法包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、自主序列复制(3SR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、使用Qβ复制酶的扩增和多重置换扩增(MDA)。

MDA是基于通过多元引物进行的靶核酸序列的链置换扩增。在MDA中，产生复制链并且在复制期间，至少一条复制链通过另一复制链的链置换复制而从靶核酸序列上置换下来。对于MDA而言，可利用的引物可包括与靶序列的一条链互补的引物组以及与靶序列的另一条链互补的引物组。而且，所述引物可为一组具有随机序列的引物。此外，所述引物可为这样的一组引物，该组中每一引物仅与靶序列的一条链杂交。

相关技术公开了一种扩增靶核酸序列的方法，其中该方法包括使一组引物、DNA聚合酶以及靶样品接触，并且在促进该靶序列的复制的条件下温育该靶样品。该靶样品未经历变性条件，并且该靶序列的复制产生复制链，其中在复制期间，所述复制链中的至少一条通过另一复制链的链置换复制而从该靶序列上置换下来。

MDA在基本上恒温的温度下进行，并且温育在足以促进引物与靶序列的杂交的低温下进行。也就是说，为了促进引物的杂交，在低于聚合酶活性最适温度的温度下进行温育。结果，只有在初始的变性和退火阶段结合、并且在相应位置处结合的引物发生扩增，因而可发生扩增偏差，由此降低扩增效率。

发明内容

本发明的示例性实施方式包括通过多重置换扩增(MDA)，包括热循环，来扩增靶核酸序列的方法。

其它各方面有些在随后的说明中进行阐述，有些可从该说明中明晰，或者可通过所介绍的实施方式的实践而获知。

本发明的示例性实施方式可包括扩增靶核酸序列的方法，其中该方法包括：使一组引物、DNA聚合酶以及靶核酸序列在溶液中接触；和温育该溶液以复制该靶核酸序列，其中该靶核酸序列的复制产生复制链并且在复制期间，所述复制链中的至少一条通过另一复制链的链置换复制而从该靶序列上置换下来，其中进行所述温育时，在DNA聚合酶活性最适温度范围与促进所述引物与该靶序列杂交的温度范围之间进行热循环。

附图说明

图1的电泳图像显示在30℃或60℃扩增靶序列时、或者在约30℃与约60℃之间进行热循环时的扩增结果。

图2显示靶序列按照图1所示在约30℃与约60℃之间进行热循环时的扩增结果和使用对照产物获得的结果。

具体实施方式

现在将详细提及示例性实施方式，其实施例说明于附图中，其中相同的附图标记始终表示相同的要素。在这方面，当前的各实施方式可具有不同的形式并且不应解释为限于本文中所进行的说明。因此，仅在下面通过参照附图描述这些实施方式以解释本说明的各方面。

根据本发明实施方式的扩增靶核酸序列的方法包括使一组引物、DNA聚合酶和靶核酸在溶液中接触。

引物可具有约5至约20bp的长度。解链温度Tm可根据所使用的引物的长度和核苷酸组成以及反应溶液中的组分(例如阳离子的浓度)而不同。本文中所用术语“解链温度Tm”是指核酸分子的多份拷贝中一半核酸链处于双链状态而另一半处于“无规卷曲”状态时的温度。例如，当引物具有约5至约20bp的长度并且引物的核苷酸是天然核苷酸时，Tm可为约10℃至约80℃。引物可具有约5至约8bp的长度。引物可具有约6bp的长度。除了天然核苷酸之外，引物还可包括修饰的核苷酸。例如，引物可包括至少一个修饰的核苷酸并且因此是耐核酸酶的，例如是耐外切核酸酶的。修饰的核苷酸可为生物素化核苷酸、荧光标记的核苷酸、5-甲基-dCTP、BrdUTP、或5-(3-氨基烯丙基)-2′-脱氧尿苷-5′-三磷酸。引物可包括DNA或RNA引物。而且，引物可用可检测的标记物进行标记。引物组可包括多个引物。引物组可包括与靶核酸的同一条链互补的两个或更多个引物，例如，三个或更多个引物、或者四个或更多个引物、或者五个或更多个引物。引物组还可包括至少一个与靶核酸的另一条链互补的引物。引物组可包括多个引物并且各引物可包括互补部分，其中这些引物的这些互补部分各自与靶核酸的不同部分互补。引物组可包括具有随机核苷酸序列的引物。在本发明的实施方式中，引物可以是长度为5bp、6bp、7bp或8bp的随机引物、或其混合物。