[发明专利]一种基于组合原理和PCR建立超大容量基因文库的新方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种在分子进化中建立基因文库的方法，利用带有共用接头的随机片段，用PCR的方法将随机片段进行互补、重叠延伸和重聚，得到一个随机组合的庞大基因文库。

背景技术

酶作为生物催化剂有催化效率高、专一性强、反应条件温和、环境友好等优势。美国能源部、商业部等部门预测：生物催化剂将成为21世纪化学工业可持续发展的必要工具。它是工业生物技术的核心，但是天然酶的性质很难适应各种工业生产的条件。酶的定向进化(Directed Evolution，DE)是为满足这种需求而改变酶的结构和性质的有效途径。

酶(或蛋白质)的定向进化又称酶的体外分子进化(In vitro Molecular Directed Evolution)，是在实验室中模拟达尔文进化的过程，以改进的诱变技术结合重组手段，建立突变体文库，创造分子的多样性，再结合灵敏的高通量筛选技术，可以迅速得到理想的非天然酶(或循环进入下一轮定向进化中以期得到更为理想的非天然酶)。定向进化与蛋白质的理性设计不同，它不用事先了解蛋白质的结构、保守位点、催化机制等，并且与自然进化相比，进化的时间缩减到数月甚至是数周。定向进化技术已被用于上百个酶的进化，大大提高了生物酶的活性和效率，在工业、农业、药业的生产上产生了巨大影响。

酶的定向进化需要两项重要的支撑技术：一是要建立具有足够量的变异体的突变体文库，为进一步筛选提供丰富的素材；二是要有合适的筛选系统，可以快速的从众多的变异蛋白质中筛选到符合目标的蛋白质。建立突变体文库的关键是创造基因的多样性，易错PCR(Error-prone PCR)和DNA重组(DNARecombination)是现有的主要方法。易错PCR是通过改变反应体系中Mg²⁺和dNTPs的浓度向相应DNA分子中随机引入错配碱基来获得酶分子的随机突变体，然后经过多重这样的小步幅迭代变异(每次1-2个氨基酸)，以相继式或组合式累积起来的变异获得理想的酶功能。易错PCR在实际应用中存在一定的局限性：一是变异速度慢；二是仅引入点突变；三是涉及的基因片段太短(小于800bp)。另一种产生突变的主要方法是体内同源基因的随机拼接或家族重排。目前，DNA重组的方法很多，如DNA改组(DNA Shuffling)、交错延伸PCR(StEP)、外显子DNA随机重组、随机引物体外重组(RPR)、渐增切割法产生杂和酶(ITCHY)、随机插入与删除(RID)，这些方法与易错PCR不同的是DNA重组依靠的是混合和连接亲本DNA的众多片段来产生突变体，称作有性PCR。在众多的DNA重组方法中，DNA改组得到了广泛的应用，其基本原理为：首先利用PCR或酶切的手段获得基因库里的一组同源基因或突变体基因片段，然后用化学(DNaseI)或物理(超声波)的手段将其随机切断成一定长度范围内的小片段，由于这些小片段之间具有一定的同源性可相互为引物，通过重聚PCR(Re-assembly via PCR)的途径延伸为具有全长的基因片段。当来自一种基因拷贝的小片段与另一种拷贝的小片段相互为引物时，即可发生模板的移位。这种方法不仅可以创造将亲本基因群中的突变尽可能组合的机会，获得导致更大变异的突变体，还能将父本基因的优势集为一体。

虽然，DNA改组及其衍生技术是获得有益突变体的有力工具，但它们通常不能用于重组同源性低于70％-80％的序列。自然界中存在很多种蛋白质，其序列不同(同源性低)而空间结构相似，为了对这些蛋白质进行重组，Benkovic研究组建立渐增切割法产生杂和酶(ITCHY)方法来产生不依赖于DNA序列同源性的重组文库。Sieber等提出了不依赖序列同源性的蛋白质重组(SHIPREC)方法，通过琼脂糖凝胶电泳回收单基因长度随机片段，保证了子代嵌合体长度的保守性，使交叉保持了适当的序列匹配，主要发生在结构上相关的位点，交叉点处的两个氨基酸仍处于它们在亲本蛋白质结构中的位置，从而提高了文库中功能杂合子的比例。Liu等提出的非同源随机重组(NRR，nonhomologous random recombination)方法，通过连接酶的随机连接，可以对两个非同源的亲本基因进行随机重组。

已有的建立突变体文库的方法对酶的进化尤其是对生产适用于医药和工业生产的生物催化剂起到了巨大的推动作用，但这些方法只能依赖现有的基因进行改造和筛选，难以开拓新的序列空间(尤其是功能改变较大时)，对于在自然界中不存在的筛选目标，如对于新出现的病毒的预防或者对于非自然的性状的筛选，则很难通过利用原有基因的改造来实现。