[发明专利]亲水的高蛋白结合的低荧光蛋白质印迹膜

说明书

本申请要求2008年8月18日提交的临时申请系列号61/189,302的优先权，其整体通过援引并入本文。 

背景技术

“印迹”或“电印迹”是指在电场影响下，用于将生物样品从凝胶转移到膜上的方法。该方法需要可固定生物分子样品用于随后检测的膜。这对于膜的表面积、孔隙和蛋白结合能力均提出了特殊要求。 

蛋白质印迹是对该技术的一种修饰，其包括在使用单克隆或多克隆抗体检测前，将蛋白质在膜上固定。在蛋白质固定到膜上之前，使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)将样品蛋白分离为天然或变性的蛋白。所述蛋白随后转移或电印迹至膜上，进而采用对靶蛋白特异性的抗体对它们进行探测并最终检测。蛋白质印迹膜通常由硝酸纤维素(NC)或聚偏氟乙烯(PVDF)制备。抗体-抗原作用的特异性能保证在复杂的蛋白混合物中鉴定单个蛋白质。 

概述而言，蛋白质印迹包括将蛋白质样品(溶胞产物)施用到聚丙烯酰胺凝胶上，随后通过电泳分离所述复杂混合物，并且将分离的蛋白质转移或“电印迹”到第二种基质，通常为硝酸纤维素或聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。转移后，膜被“封闭”以防止抗体与膜表面的非特异性结合。本领域技术人员已知许多抗体标记或加标签策略。在最简单的方案中，转移的蛋白质与用作探针的第一酶标记的抗体孵育或复合，阻断非特异性结合位点后，加入适合的底物以与酶复合，其一起反应形成产色的、化学发光的或可荧光检测的产物，以允许分别进行目测、化学发光或荧光检测。最灵敏的检测方案利用了化学发光或荧光现象。在化学发光检测中，酶-底物复合物产生可检测的光学发射(化学发光)。这些发射被记录并采用适当的检测器例如胶片或光子设备测量。信号存在或不存在表明该溶胞产物中是否有特定的蛋白质存在，信号强度与所关注的蛋白质的水平有关，其在某些情况下是可定量的。 

硝酸纤维素膜普遍用于免疫检测工作、尤其是蛋白质印迹中。其部分是由于历史原因，部分因为其易用性。硝酸纤维素印迹膜不需要有机液体预湿润步 骤(采用疏水膜时需要)。疏水膜在装配到印迹转移组件之前需要首先用醇预湿润，随后用水交换以除去醇的步骤。本质疏水的膜进行该装配的时间有限，该膜的干燥潜能是显著的。干燥后，膜不可被重新润湿，除非重复进行预润湿步骤。一旦膜与凝胶接触，在转移前拿开则会有效损坏凝胶和其含有的分离蛋白样品。预湿润步骤是耗时的，是很不利的步骤。亲水膜将在更长的时间内保持湿润，并且如果其在装配前干燥，可用水重新润湿。 

硝酸纤维素印迹膜是水可润湿的，在多数印迹应用中均显示了令人满意的性能。但硝酸纤维素并不如PVDF那样在机械性或化学性上稳定。PVDF在相当长的时间内保持其机械完整性，而NC将变脆和掉色。PVDF膜印迹可被剥离抗体并被重新探测，而NC印迹不可。NC有被空气氧化的倾向，这可能是危险的。其需要单独的废物流，当处理时需要用湿润剂(通常为水)湿润。 

疏水的PVDF印迹膜具有与NC印迹膜相同的蛋白结合能力，但显示出更好的印迹性能。在同样的条件下，与NC相比，这些PVDF膜能检测到低得多的样品浓度。低背景荧光疏水PVDF印迹膜在使用荧光检测方案的同时表现出同样增强的样品检测能力。 

因此需要提供亲水的PVDF膜用于诸如蛋白质印迹的免疫检测试验，其可以获得更低的样品检测限和疏水PVDF膜的低背景荧光。本发明满足了这些需要。 

发明内容

发明概述 

用于改变基质表面能，尤其是关于意图接触生物系统的表面的表面修饰领域的技术人员将会同意，亲水表面修饰通常显示出低的蛋白质结合性质。本文中公开的实施方案偶然且意料不到地发现，来源自某种单体丙烯酰胺混合物、并且使用自由基聚合反应形成的立体聚合物可获得亲水且显示高蛋白结合水平的表面修饰。 

许多现有技术描述了含羟基单体、通常为含羰基酯的丙烯酸酯聚合物在制备具有亲水性质和对蛋白结合的高度抗性的膜表面修饰中的应用。然而，已知这类单体的聚合物不耐强碱溶液。例如1.0当量的氢氧化钠溶液将含羰基的丙烯酸酯聚合物水解为含丙烯酸的聚合物。这样的含丙烯酸的聚合物在特定pH条件下是带离子电荷的，并将吸引和结合相反电荷的蛋白或生物分子，由此增加吸 着和膜的污染。此外，含丙烯酸的聚合物在水中膨胀至一定的程度，使得孔通道收缩，由此降低了膜通透性和生产率。而且，由含羟基单体构成的聚合物，例如羟基丙烯酸酯进一步在强碱溶液中反应，降解成可溶的低分子量片段，其溶解并暴露了下面的底物多孔介质或膜。