[发明专利]反相高效液相色谱法分离多黏菌素E甲磺酸钠及其类似物

说明书

技术领域

本发明涉及一种色谱分离分析方法，具体是一种分离分析多黏菌素E甲磺酸钠及其异构体或类似物的高效液相色谱(HPLC)方法，属于药物分析领域。

背景技术

很多严重的感染是由具有很强耐药性的绿脓假单胞菌引起的，而多黏菌素类药物对该类感染的致病菌具有较好的抑制效果。自从硫酸多黏菌素类化合物于1947年从不同种类的多黏芽孢杆菌提取得到，就被应用于体外抗菌实验中。但由于其毒副作用较大，应用并未得到普遍推广。而以其作为原料合成的多黏菌素E甲磺酸钠则较其毒性低，且抑菌效果不减。而目前，国内尚无对该类药物的分析方法，因此，对该类药物的分析研究成为当前一项具有重要意义的工作。

发明内容

本发明的目的在于填补目前国内对于多黏菌素E甲磺酸钠及其异构体或类似物的分离及分析方法的空白，提供一种能准确的分离分析多黏菌素E甲磺酸钠及其异构体或类似物的高效液相色谱方法，从而对该类药物进行分离分析研究。

本发明方法的特征是液相色谱条件为：以烷基键合硅胶填充柱为固定相，流动相为有机溶剂和酸的水溶液组成的混合溶剂。

当以烷基键合硅胶填充柱为固定相时，优化条件为C18烷基键合硅胶填充柱。更优为OptimapakC18烷基键合硅胶填充柱。

当流动相为有机溶剂和酸的水溶液组成的混合溶剂时，有机溶剂可以为乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇、四氢呋喃、丙酮，或上述两种及两种以上有机溶剂的混合物等，酸可以为盐酸、硫酸、磷酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸、烷基磺酸、苯磺酸、取代苯磺酸、五氟丙酸、七氟丁酸、九氟戊酸、十一氟己酸、十三氟庚酸、十五氟辛酸或上述两种及两种以上酸的混合物等，混合溶剂组成的体积比为有机溶剂∶酸的水溶液3∶97～80∶20。优化条件为：流动相中有机溶剂和酸的水溶液组成的混合溶剂体积比为15∶85～50∶50。更优化条件为：在10～20分钟内，混合溶剂组成的体积比(乙腈∶三氟乙酸水溶液)在15∶85～60∶40内线性变化，其中三氟乙酸的体积浓度为0.05％～1％。等度洗脱的优化条件为混合溶剂中乙腈∶三氟乙酸水溶液体积比为20∶80～45∶55。

下面通过以下的实验研究对本发明做进一步说明。

1.分离目标

分离目标为合成多黏菌素E甲磺酸盐过程中所产生的多黏菌素E甲磺酸盐及其类似物，多肽硫酸盐结构式见附图1，多黏菌素E甲磺酸盐的结构式见附图2。

2.多黏菌素E甲磺酸钠供试品溶液制备

多黏菌素E甲磺酸钠极易溶于水，因此确定了标准品的制备首先选用水溶解，然后以适量的乙腈定容。优选流动相来溶解标准品。

3.高效液相色谱条件

(1)色谱柱选择确定

选用烷基键合硅胶固定相为分离介质进行试验，比较了Agela公司C18、C8、C4烷基键合硅胶填料柱，Agilent公司C18、C8、C4烷基键合硅胶填料柱，Waters公司C18、C8、C4烷基键合硅胶填料柱，Shimadzu公司C18、C8、C4烷基键合硅胶填料柱，Optimapak公司C18、C8、C4烷基键合硅胶柱等。确定了C18柱有较好的分离效果，以Optimapak公司C18烷基键合硅胶填充柱(150×4.6mmi.d，5μm，pH范围2.0～8.0)为优，因此选用Optimapak公司C18柱。

(2)检测方法确定

多黏菌素E甲磺酸钠具有紫外吸收，因此可用紫外检测器检测。样品分别溶于水、该方法采用的流动相来测定其紫外光谱，数据见表一。对比这两个波长检测的HPLC谱图，以波长214nm波长图谱的吸收更明显，因此确定：用紫外检测法波长选用212～216nm。此外，还可用蒸发光散射检测器来检测。

表一多黏菌素E甲磺酸钠紫外光谱数据

(3)流动相的选择确定

多黏菌素E甲磺酸钠是一种肽盐，结构复杂，性质易变，因此选择合适的流动相使其得到较好的分离又保持目标物质的性质不变是方法的关键。

根据多黏菌素E甲磺酸钠的理化性质和经验，我们选用甲醇-水、乙腈-水、异丙醇-水溶剂系统分别进行等度洗脱对比筛选。色谱柱为Optimapak公司C18柱(150×4.6mmi.d，5μm，pH范围2.0～8.0)，检测波长212～216nm，流速1.0mL/min，温度为室温。结果表明，混合溶剂乙腈-水具有更好的分离能力和结果，因此选用乙腈-水溶剂系统作为流动相。