[发明专利]一种提高辣(甜)椒游离小孢子培养胚状体诱导率的方法

权利要求书

1.一种提高辣、甜椒游离小孢子培养胚状体诱导率的方法，包括以下步骤：

(1)试材的确定：选取具有综合性状优良的辣、甜椒基因型作为试验材料；

(2)培养基的制备：基本培养基为Nitsch组分；

固体培养基-Nitsch组分+2％麦芽糖+1.0％活性炭+0.6％琼脂，pH为6.0，于高温 121℃高压1.1Mpa条件下灭菌18分钟；

液体培养基-Nitsch组分+2％麦芽糖+0.5mg/L ZT+1.0mg/L IAA，pH为5.8，以0.45μm 和0.22μm微孔滤膜抽滤灭菌；

分化培养基：Nitsch组分+2％蔗糖+0.9％琼脂，pH为6.0，于121℃，1.1Mpa条件下 灭菌18分钟；

(3)培养基的分装：于超净工作台上将已灭菌的固体培养基在凝固之前分装于已灭 菌的60×15mm培养皿中，每皿5ml；待固体培养基凝固后，在接种花药前加入每皿3ml液 体培养基备用；

(4)花蕾的选择：在初花期和盛花期，通过铁钒-苏木精压片法镜检确定小孢子发 育时期与外部形态的对应关系，准确找到发育时期为单核靠边期的花蕾，此时花蕾的外部 形态特征表现为花瓣等于或略大于花萼，并且花药尖端有10～25％呈淡紫色；

(5)花蕾预处理：将选取的适宜花蕾置于4℃条件下处理1天；

(6)花蕾消毒：在超净工作台上，用70％的酒精表面消毒30秒钟，之后用2％的次氯 酸钠消毒10分钟，然后用无菌水冲洗3次，时间分别为1、4、10分钟；

(7)花药的剥取：于超净工作台上，在无菌培养皿中用镊子从花蕾中剥取花药，彻 底去除花丝，操作中尽量避免损伤花药；

(8)花药接种：在装有固体培养基的培养皿中，加入液体培养基每皿3ml，之后接种 花药12枚/皿，用Parafilm膜封口；

(9)游离小孢子培养：将接种的培养皿进行暗培养；

(10)胚状体的形成：培养期间各种类型的胚状体陆续出现，8周后将子叶胚接种于 分化培养基上，形成再生植株；

其特征是：

(1)提高花蕾质量：培育壮苗、及时定植、合理肥水、及时摘取果实和已开放的花， 保持植株旺盛的生长势；使适宜取蕾的初花期和盛花期处于白天温度25～30℃，夜间温度 20℃左右的环境；

(2)采用从培养基、花蕾的选择、花蕾预处理、花蕾消毒到花药剥取全程低温控制： 液体培养基加入之前于4℃低温预冷保存；选择健壮植株的花蕾，晴天早晨8∶00～10∶00 摘取适宜的花蕾用封口袋放于盛有冰的冰盒暂存；花蕾消毒用的70％酒精、2％次氯酸钠和 无菌水使用之前皆在4℃低温预冷保存，消毒后的花蕾浸泡于无菌水中置于冰浴上备用； 在超净工作台上，将无菌培养皿置于冰浴上剥取花药；

(3)游离小孢子培养：将接种花药的培养皿置于7℃条件下暗培养一周后转于28℃ 下继续暗培养，经过12～18天后花药自然开裂，将小孢子释放于液体培养基中。