[发明专利]一种提高辣(甜)椒游离小孢子培养胚状体诱导率的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高辣(甜)椒游离小孢子培养胚状体诱导率的方法，属于利用细胞遗传学理论与育种技术领域。 

背景技术

在辣(甜)椒育种工作中，自交系的选育是非常重要的工作，但常规选育方法存在周期长、费用高、占地多等问题。单倍体育种是解决这一问题的重要方法，它可以大大提高育种效率，缩小育种群体的规模，并缩短育种年限。游离小孢子培养是获得单倍体的主要途径。经小孢子培养得到的花粉株系间性状变异幅度大，超亲现象和出现特殊优良性状的频率要显著高于常规育种；株系内性状整齐，世代间稳定性强；通过小孢子培养获得的自交系具有高度的纯合性，杂交配组可获得更强的杂种优势；通过该法建立起来的DH群体是开展ALFP、RAPD、SSR等分子标记和基因图谱研究用的理想材料。因此，游离小孢子培养技术在遗传和育种研究中具有十分重要的应用价值。 

辣(甜)椒游离小孢子培养获得胚状体技术在国内外已有成功的研究报道，张菊平等获得了专利(专利号：ZL 200610042616.0)，但目前国内报道显示，辣(甜)椒游离小孢子培养胚状体诱导率还比较低，最高为1.83个胚状体/花药(刘凡，赵泓，陈斌，张月云.辣椒游离小孢子细胞团培养的胚状体形成.分子细胞生物学报，2007，40(6)：371-379)，在实际应用中受到一定限制。因此，如何提高游离小孢子胚状体诱导率，是关系到辣(甜)椒游离小孢子培养技术能否广泛应用于遗传育种研究的关键技术之一。 

发明内容

本发明旨在提供一种提高辣(甜)椒游离小孢子胚状体诱导率的方法，使得通过小孢子培养快速获得纯合自交系的技术应用于辣(甜)椒遗传和新品种选育。 

本发明的基本原理是：在一定条件下，离体培养植物小孢子的发育可以脱离在体内时的正常的发育轨道，通过分裂增殖最终形成胚状体或愈伤组织。将形成的胚状体转接于适宜的培养基上时，可获得完整的再生植株。 

本发明突出的创新点是：通过提高培养用花蕾质量，采用从花蕾的取样、前期预处理、花蕾消毒到花药剥取的全程低温控制，并于7℃黑暗预培养一周后转到28℃黑暗培养的关键技术，使得辣(甜)椒游离小孢子培养胚状体的诱导率最高达8.4个胚状体/花药，显著高于 已公布的1个胚状体/花药的专利技术(专利号：ZL 200610042616.0)。 

提高胚状体诱导率的方法(本发明的创新)： 

(1)提高花蕾质量：培育壮苗、及时定植、合理肥水、及时摘取果实和已开放的花，保持植株旺盛的生长势；使适宜取蕾的初花期和盛花期处于白天温度25～30℃，夜间温度20℃左右的环境。 

(2)花蕾的选取：晴天早晨8:00～10:00选取花瓣等于或略大于花萼且花药尖端10％～25％呈淡紫色的花蕾，用封口袋盛装于冰盒中暂存。 

(3)花蕾的低温预处理：将选取的适宜花蕾在4℃低温条件下预处理1天。 

(4)低温灭菌和花药的剥取：灭菌用的酒精(70％)、次氯酸钠(2％)和无菌水皆在4℃低温保存。灭菌的花蕾用无菌水洗涤后，浸泡于无菌水中并置于冰浴上备用，剥取花药在冰浴上进行。 

(5)低温保存液体培养基：液体培养基在加入固体培养基之前置于4℃冰箱低温保存。 

(6)适温培养：将接种的花药于7℃低温黑暗预培养一周后，转于28℃下继续黑暗培养直至形成子叶胚。 

本发明通过以下步骤完成： 

(1)试材的确定：选取具有综合优良性状的辣(甜)椒基因型作为试验材料。 

(2)培养基的制备 

基本培养基为Nitsch组分(Nitsch and Nitsch 1969)。 

固体培养基-Nitsch组分+2％麦芽糖+1.0％活性炭+0.6％琼脂，pH为6.0，于121℃，1.1Mpa条件下灭菌18分钟。 

液体培养基-Nitsch组分+2％麦芽糖+0.5mg/LZT+1.0mg/LIAA，pH为5.8，以0.45μm和0.22μm微孔滤膜抽滤灭菌。 

(3)固体培养基的分装：于超净工作台上将已灭菌的固体培养基在未凝固之前分装至已灭菌的60×15mm培养皿中备用，每皿5mL。 

(4)花蕾的选取：选取小孢子发育时期大多处于单核靠边期的花蕾。 

(5)花蕾的预处理：将选取的适宜花蕾进行4℃低温预处理1天。