[发明专利]一种抗肿瘤蛋白及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种蛋白及其制备方法，特别是一种来源于真菌的抗淋巴瘤蛋 白及其制备方法。

背景技术

恶性淋巴瘤属于恶性肿瘤的一种，往往发生在年轻、壮年，对劳动力的影 响非常大，因此引起了医学界特别的重视，发病的年龄是20岁到40岁的青壮 年比较多见平均死亡年龄都大大低于45岁。

淋巴瘤是起源于淋巴系统的恶性肿瘤，分为霍奇金病和非霍奇金淋巴瘤两 大类。它的发生与淋巴细胞增殖分化产生的免疫细胞恶变有关，其病因目前尚 未完全明确，可能与一些病毒的感染有关，比如EB病毒、肝炎病毒以及幽门螺 旋杆菌病毒等。

目前，全球平均每9分钟就有1个新发病人。我国淋巴瘤发病率为0.02‰。 每年新增患者约2.5万人，死亡人数近2万，淋巴瘤的威胁正在迅速显现。在 亚洲地区，非霍奇金淋巴瘤发生率远高于霍奇金氏病，大约为9∶1，由于恶 性程度更高、预后更差，所以一般谈到淋巴瘤就是指非霍奇金淋巴瘤。在我国， 在恶性肿瘤发病率排名中，男性占第9位，女性占第10位。早期单药治疗非 霍奇金淋巴瘤，治疗效果不明显，而且极易复发，患者存活率低。自1976年 开始用CHOP方案(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、泼尼松)治疗以来，其5年生 存率上升到30％～40％，总体缓解率80％～90％。在造血干细胞移植应用于治 疗非霍奇金淋巴瘤后，进一步提高了治愈率。但上述治疗方法易损伤正常组织， 特别是伤害在抗肿瘤机制中占重要地位的机体免疫系统，而且常难彻底消灭肿 瘤细胞，很多临床证据表明，残留或移植时回输的肿瘤细胞是导致复发的主要 原因，患者生存期因而缩短。目前，随着医学的发展，生物治疗因其靶向性以 及能达到体内肿瘤细胞的极微量残留，且副作用小等优点而将成为一种前景很 好的新的治疗方法。

人们已经从真菌中发现了较多的抗肿瘤活性物质或成分，这些真菌包括一 些大型的可食用菌类如香菇、巴西蘑菇、阿魏蘑菇、灵芝等，也包括有一些虫 体内生真菌、植物内生或共生真菌以及海洋真菌等。发现的抗肿瘤物质有多糖、 蛋白/肽类、小分子化合物以及一些尚不明确的成份。

紫皱盖罗鳞伞又叫喜山罗鳞伞(Rozites emodensis(Berk.)Moser)是一 类产自较高海拔地区的可食用大型野生菇类(蕈类)，在云南、西藏、四川均 有分布。本发明从该蕈体内分离出一类分子量约为26kD的蛋白质，具有较为 专一的抗淋巴瘤活性，未见现有文献报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗肿瘤蛋白RE26，其N末端封闭，肽链中含有SEQ ID NO：1所示的序列NGLEEEETLLLLFFPP和SEQ ID NO：2所示序列NGTEQE， 来源于紫皱盖罗鳞伞(Rozites emodensis(Berk.)Moser)子实体，并在子 实体展开的伞盖中具有高含量，所述蛋白的分子量为26kD，等电点为4.3。

进一步的，所述蛋白经羟胺切割后得到24kD和17kD两条片段，24kD片 段N段氨基酸序列如SEQ ID NO：1，17kD片段N端序列如SEQ ID NO：2所示。

所述蛋白可以特异识别并诱导肿瘤细胞特别是淋巴瘤细胞凋亡。

本发明的另一方面，涉及制备上述蛋白的方法，包括：

1)获得RE26粗提液：采取紫皱盖罗鳞伞(Rozites emodensis(Berk.) Moser)新鲜子实体，用蒸馏水洗净、沥干，加于一倍体积的pH 8.0的0.02mol/l Tris-HCl缓冲液，4℃匀浆并温和搅拌过夜，离心后，将上清过滤去悬浮物即 获得RE26粗提液。

2)分离纯化步骤1)的RE26粗提液，获得RE26蛋白纯品。

步骤2)所述的分离纯化方法为离子交换层析，先用填料粒径为45-300μm 阴离子或阳离子交换树脂对RE26粗提液进行粗分离，再用填料粒径为 15-45μm的阴离子或阳离子交换树脂进一步分离得到RE26纯品。