[发明专利]一种谷胱甘肽高产菌种的遗传改造方法

权利要求书

1.一种谷胱甘肽高产菌种的遗传改造方法，其特征在于：步骤如下：

第一步：从酿酒酵母S.cerevisiae INVSc1基因组模板中，扩增目的基因GSH1、GSH2，然后分别装入pGAPZA中，得到重组质粒pGAPZA-GSH1和pGAPZA-GSH2；

第二步：以所述的重组质粒pGAPZA-GSH1和pGAPZA-GSH2为模板，采用DNA改组技术“体外快速进化”γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶，得到质粒pGAPZA-GSH1M和质粒pGAPZA-GSH2M；

第三步：以所述的质粒pGAPZA-GSH1M和质粒pGAPZA-GSH2M构建质粒pGAPZA-GSH1M-GSH2M和重组甲醇酵母；

第四步：应用重组酵母发酵实验测定GSH的摩尔转化率。

2.根据权利要求1所述的一种谷胱甘肽高产菌种的遗传改造方法，其特征在于：第一步是按照如下方法实现的：

(1)扩增目的基因：GSH1

模板：S.cerevisiae INVSc1

引物：

GSH1上游引物gsh1-1：GAAGCTCGAGACCATGGGACTCTTAGCTTTGGGCACGCC

GSH1下游引物gsh1-2：TCCTCGGGGCCCAATGGTCACGGCGTCTGGCTACG

PCR扩增反应：DNA模板1μl，，10×PCR缓冲液2μl，引物2μl，dNTP 5μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，总反应体积为20μl，94℃变性5min，94℃ 45s，58℃90s，72℃ 120s，35个循环。扩增产物通过1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，片段大小：2405bp；

(2)扩增目的基因：GSH2

模板：S.cerevisiae INVSc1

引物：

GSH2上游引物gsh2-1：CCTACTCGAGACCATGGCACACTATCCACCTTCCAAGG

GSH2下游引物gsh2-2：GTACATGGGCCCTTAGTAAAGAATAATACTGTCCAAAC

PCR扩增反应：DNA模板1μl，10×PCR缓冲液2μl，引物2μl，dNTP 5μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，总反应体积为20μl，94℃变性5min，94℃ 45s，58℃90s，72℃120s，35个循环，扩增产物通过1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，片段大小：1476bp；

(3)将GSH1和GSH2装入pGAPZA载体

分别用XhoI和ApaII双酶切上述PCR扩增产物和pGAPZA载体，然后在T4连接酶下16℃连接过夜，pGAPZA，得到重组质粒pGAPZA-GSH1和pGAPZA-GSH2，转化E.coliJM109，提取重组质粒进行酶切验证。

3.根据权利要求1所述的一种谷胱甘肽高产菌种的遗传改造方法，其特征在于：第二步是按照如下方法实现的：

采用错误倾向PCR；

模板：质粒pGAPZA-GSH1和pGAPZA-GSH2，按照Stratagene Co.的Gene Morph IIRandom Mμtagenesis Kit试剂盒说明，采用多种反应条件及不同条件的组合：(1)增加MgCl₂，分别试用了几种MgCl₂浓度：2.5、5.0、7.5mmol/L；(3)分别试用了两组增高的dNTP浓度(至1mmol/L)：dTTP和dCTP为一组，dATP和dGTP为另一组；(3)在常规PCR的基础上，加入dITP，同时将dATP或dGTP降至常规量的1/10，即0.02mmol/L，PCR产物采用噬菌体表面展示技术筛选；

酶活测定：取5mL培养液于12000r/min离心15min，弃上清，用0.05mol/L pH 7.0的磷酸缓冲液洗涤菌体.将菌体再用上述缓冲液5mL悬浮后超声波90kHz破碎10min，加入GSH前体反应物质，谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸浓度均为40mmoL/L，MgCl₂、ATP 50mmol/L，37℃反应30min，获得的高产进化酶基因测序，命名为：质粒pGAPZA-GSH1M和质粒pGAPZA-GSH2M，用ALLOXAN试剂衍生化法测定酶活及GSH含量。