[发明专利]一种谷胱甘肽高产菌种的遗传改造方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种菌种的遗传改造方法，特别是涉及一种应用于医药、食品及饲料领域的谷胱甘肽高产菌种的遗传改造方法。

背景技术

目前，谷胱甘肽(GSH)的生产方法主要有萃取法、化学合成法、固定化细胞法和发酵法，其中，固定化细胞法又称为酶法。

采用萃取法生产GSH，是使用植物种子胚芽或酵母作为原料，水、有机溶液或稀醇作为溶剂萃取得到GSH，采用萃取法生的GSH纯度和收率都不高，若在药品或试剂中应用萃取法制得的GSH，还需要在萃取法中组合离子交换等色层分离步骤进一步纯化，生产工艺落后、生产规模小、产量低且质量不高。

采用化学合成法生产GSH的生产工艺已经较为成熟，但是成本高、反应步骤多、反应时间长、操作复杂、需要光学拆分，并且，化学合成法还存在环境污染等问题。

采用固定化细胞法，或称酶法生产GSH，具有生产过程简化、生产效率高等优点，由于从前体氨基酸生物合成GSH的二步反应都需要消耗ATP，因此，需要在反应过程中实现ATP循环再生，而要在反应过程中实现ATP循环再生，方法较为复杂。

采用发酵法生产GSH，是选育或构建GSH合成能力强且胞内谷胱肝肽含量高的微生物，利用筛选和优化的培养基配方，建立和优化发酵控制策略，改进和提高下游过程技术等方法，最终提高GSH的产率和质量的方法，发酵法是目前GSH的主要生产方法，所选用的微生物一般是酵母，多为酿酒酵母和假丝酵母中的某些种，经诱变筛选得到乙硫氨酸、Zn²⁺等物质的抗性株。

目前，还有采用基因工程的方法获得高产还原型GSH菌株的方法，该方法是以甘油和氨水，以及前体半胱氨酸为主要原料，在7.5L发酵罐规模，70小时内发酵产量可达5.0g/L发酵液，半胱氨酸转化为GSH的摩尔转化率达45％以上。

但是，由于GSH的市场空缺较大，应用上述方法生产的GSH远不能满足市场需求。

发明内容

本发明旨在提供一种以毕赤酵母Pichia pastoris为改造对象的GSH高产菌种的遗传改造方法。

本发明一种谷胱甘肽高产菌种的遗传改造方法的技术方案如下：

本发明一种谷胱甘肽高产菌种的遗传改造方法的步骤如下：

第一步：从酿酒酵母S.cerevisiae INVSc1基因组模板中，扩增目的基因GSH1、GSH2，然后分别装入pGAPZA中，得到重组质粒pGAPZA-GSH1和pGAPZA-GSH2；

第二步：以所述的重组质粒pGAPZA-GSH1和pGAPZA-GSH2为模板，采用DNA改组技术“体外快速进化”γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶，得到质粒pGAPZA-GSH1M和质粒pGAPZA-GSH2M；

第三步：以所述的质粒pGAPZA-GSH1M和质粒pGAPZA-GSH2M构建质粒pGAPZA-GSH1M-GSH2M和重组甲醇酵母；

第四步：应用重组酵母发酵实验测定GSH的摩尔转化率。

本发明一种谷胱甘肽高产菌种的遗传改造方法的有益效果在于：

(1)本发明一种谷胱甘肽高产菌种的遗传改造方法选用的毕赤酵母Pichia pastoris本身具有很好的安全性，酵母培养基中不含有毒物质和致热源；发酵方法简便，发酵原料易得，节省能源，产量大，成本低。

(2)本发明一种谷胱甘肽高产菌种的遗传改造方法选用的启动子GAP不需甲醇诱导，发酵工艺简单，其产量很高。

(3)本发明一种谷胱甘肽高产菌种的遗传改造方法在菌种基因改造过程中，减少了前体物的使用，从而降低生产成本。

具体实施方式

本发明一种谷胱甘肽高产菌种的遗传改造方法的具体步骤如下：

第一步：从酿酒酵母S.cerevisiae INVSc1基因组模板中，扩增目的基因GSH1、GSH2，然后分别装入pGAPZA中，得到重组质粒pGAPZA-GSH1和pGAPZA-GSH2：

1.扩增目的基因：GSH1

模板：S.cerevisiae INVSc1

引物：

GSH1上游引物gsh1-1：GAAGCTCGAGACCATGGGACTCTTAGCTTTGGGCACGCC(加了Kozak序列)(XhoI)

GSH1下游引物gsh1-2：TCCTCGGGGCCCAATGGTCACGGCGTCTGGCTACG(ApaI)