[发明专利]益生菌乳制品中双岐杆菌的快速定性、定量测定方法有效
| 申请号： | 200910177909.3 | 申请日： | 2009-09-21 |
| 公开（公告）号： | CN101712988A | 公开（公告）日： | 2010-05-26 |
| 发明（设计）人： | 张和平;包秋华;孙志宏 | 申请（专利权）人： | 内蒙古农业大学 |
| 主分类号： | C12Q1/68 | 分类号： | C12Q1/68;G01N21/64;C12R1/01 |
| 代理公司： | 北京君智知识产权代理事务所 11305 | 代理人： | 向华 |
| 地址： | 010018 内蒙古自治区呼和浩*** | 国省代码： | 内蒙古;15 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 益生菌 乳制品 中双岐 杆菌 快速 定性 定量 测定 方法 | ||
1.一种益生菌乳制品中双岐杆菌(Bifidobacteria)的快速定量测定方法， 其特征在于该方法是以待测样品cDNA和标准品的DNA为模板，用双岐杆 菌的种特异性引物，以相同的体系同时进行双岐杆菌的16S rRNA的基因片 段的荧光定量PCR扩增；通过标准曲线和待测样品的Ct值求出益生菌乳制 品中双岐杆菌的起始模板量，步骤如下：
(1)采用Trizol法提取发酵乳制品总RNA；
(2)反转录扩增
反应体系10.0μL：2.0μL 5×PrimerScript Buffer(TakaRa DRR063A)、 0.5μL PrimerScript RT Enzyme Mix I、0.5μL Random 6mers(100μM)、Total RNA(＜500ng)，RNase Free dH2O补足至10.0μL；
反转录扩增反应条件：37℃反应15min；85℃变性5S，在温度-20℃下 保存；
(3)实时荧光定量PCR
反应体系25.0μL：Premix Ex TaqTM，各0.5μL 10μmol/L 上、下游引物Bf和Br，2.0μL cDNA模板，9.5μLdH2O；
荧光定量PCR反应参数：95℃变性25S；95℃变性10S，60℃退火22S， 40个循环；每个样品重复3次；在温度4℃保存；
(4)外标准品的制备和标准曲线的绘制
构建了含有目的条带的重组质粒pBT的DNA作为标准品，以此为标 准品制作标准曲线对未知样品的绝对量进行测定。
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