[发明专利]益生菌乳制品中双岐杆菌的快速定性、定量测定方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及含有益生菌的乳制品技术领域。更具体地，本发明涉及一 种在益生菌乳制品中双岐杆菌(Bifidobacteria)的快速定性、定量测定方法。

【背景技术】

益生乳制品因其丰富的营养价值和特殊的益生功效成为人们关注的热 点。目前市场上益生菌及含有益生菌的乳制品种类繁多，并且每年以高速 度增长。对其质量的监管和认证，尤其在定性、定量检测方面缺乏科学、 合理、快速的方法。传统方法中对益生菌的定性、定量检测，仍采用生理 生化反应和选择性培养基纯培养分离计数的方法。传统方法易受培养条件、 菌种特性等因素影响，检测效率有限，而且受外界环境因素和培养基性能 的影响大，检测结果缺乏稳定性和可靠性，且耗时耗力。PCR技术一经出 现就被广泛应用于分子生物学和微生物学等领域。实时荧光定量PCR (Real-time PCR)的出现更是实现了PCR技术从定性到定量的飞跃，避免了 传统PCR定量鉴定中交叉污染的问题。具有特异性强、重复性好、准确、 快速等优点，成为了分子生物学和微生物学领域定量检测的重要方法。采 用乳杆菌种属特异性PCR和实时荧光定量PCR技术，建立简便、快速、准 确的益生菌乳制品中双岐杆菌的定性、定量测定方法，可以简化益生菌的 检测程序、提高检测效率，能提高我国益生菌的检测能力，完善保健食品 的质量监管，并为益生菌产业的长远发展提供技术保障。

本发明针对益生菌乳制品中含有的双岐杆菌，依据参考文献自行设计 双岐杆菌的16S rRNA基因序列的种属特异性引物，应用此引物进行种属特 异性PCR和实时荧光定量PCR反应，通过琼脂糖凝胶电泳图谱分析和实时 荧光定量PCR图谱分析，建立益生菌乳制品中双岐杆菌的简便、快速、准 确的定性和定量测定方法。

【发明内容】

[要解决的技术问题]

本发明的目的是提供一种益生菌乳制品中双岐杆菌的快速定性方法。

本发明的另一个目的是提供一种益生菌乳制品中双岐杆菌的快速定量 方法。

[技术方案]

本发明是通过下述技术方案实现的。

本发明涉及一种益生菌乳制品中双岐杆菌的快速定性测定方法。该方 法的步骤如下：

A、模板DNA的制备

(1)取益生菌发酵乳样品于2.0mL离心管中，加入500μL TE缓冲液， 混合均匀，再置于液氮中进行冻结，冻结后取出放入65℃水浴中进行融化 4-6min，如此反复进行冻融3-5次；

(2)冻融结束后，往其中加入60.0μL10％(质量体积比)的SDS和 10.0μL 10mg/mL蛋白酶K，在摇床中在温度37℃下以200r/min进行摇动 4h；

(3)加入100.0μL5M NaCl和100μL CTAB/NaCl溶液(将4.1gNaCl 溶于80ml水中，再缓慢加入10g CTAB得到的溶液)，65℃水浴10min。

(4)然后，加入与在步骤(3)得到的溶液等体积的苯酚、氯仿和异 戊醇混合物，它们的体积比分别是25∶24∶1，混匀，再以10000g/min离 心10min，该溶液分成上层水相、中间固相与下层有机相；

(5)吸取上层水相，加入与所述水相等体积的上述苯氯仿和异戊醇混 合物抽提一次，分离上清液；

(6)往所述的上清液中加入0.1倍体积的3mol/L醋酸钠和1倍体积的 冰异丙醇，混合均匀静置30min，以10000g离心5min得到总DNA沉淀；

(7)所述沉淀用70体积比％乙醇水溶液洗涤2次，再在室温下自然干 燥，得到模板DNA；然后加入50.0μL无菌超纯水回溶，在温度-20℃下保 存备用。

B、PCR扩增

反应体系25.0μL：2.5μL 10×PCR Buffer、1.0μL 25mmol/L Mg²⁺、2μL 2.5mmol/L dNTPs、2.5μL5mmol/L上下游引物、1.0μL 50ng/μL DNA模板， 0.25uL 5U/μL Taq酶，二次蒸馏水补足至25.0μL；

PCR反应条件：95℃预变性3min；95℃变性40S，62℃退火30S，72℃ 延伸1min，循环40次；72℃延伸8min，得到PCR扩增产物，在温度4℃ 下保存；

取3.0μL PCR产物使用1％琼脂糖凝胶进行检测；