[发明专利]用于生产目的物质的禽细胞系

说明书

本申请是申请日为2003年3月7日，申请号为03810120.3，发明名称为“用于生产目的物质的禽细胞系”的中国专利申请的分案申请。 

技术领域

本发明涉及一种生产禽类细胞系，特别是禽干细胞的方法，包含逐步或全部撤消生长因子、血清和/或饲养菌苔。该自主建立的细胞系是能在基础培养基中无限增殖的黏附或非黏附性细胞。本发明还涉及源于特别利于生产疫苗和目的物质的细胞系的细胞。 

背景技术

干细胞在体外培养时可区分为源于胚胎，胚胎的部分或甚至成体组织的细胞。表达干细胞被认为是源于胚胎或成体的多能性细胞，有自我更新的能力，且能产生特定的分化细胞。换句话说，干细胞是源于任何能在培养过程中无限分裂且产生与母细胞具有同样增殖和分化能力的子细胞的非癌细胞。这些分离细胞显示了特定的形态学和免疫细胞化学特征。也可以区分以下概念： 

-胚胎干细胞(CES细胞)，是从培养的全部或部分较早期胚胎(囊胚期)中获得的具有典型特征的干细胞。这些CES细胞在体外表现出干细胞的所有特性，体内，在对胚胎的形态发生及以任何形式被再植入无论何种胚胎时参与幼植体的移地发育中表现出独特的能力。 

-体干细胞(SSC)，在体外培养时具有干细胞的全部特征，但与CES细胞不同，在植入胚胎后没有在体内形成生殖腺的潜力。他们仅是对胚胎中成体组织的形态发生有贡献。 

与已经分化的起始细胞不同，干细胞没有显出易于鉴定特征的形态学分化状态(成纤维细胞，脂肪细胞，巨噬细胞，等)，但显出可被鉴定的增殖或非分化状态。这些状态导致细胞不同的行为，如体外的快速增殖，典型的形态学特征，不同分子标记的出现，对生长因子的 不同需求及对诱导分化的特定刺激的应答能力。它们对于复制衰老期，大部分已分化的起始细胞的临界时期并不敏感，包括如成纤维细胞。 

为了在体外较长时期地维持禽干细胞，有必要观察如Pain等，1996；US6,114,168和EP787 180中所述的特定培养和维持的条件。 

在体外充分的培养基和生长因子条件下培养的起始细胞只能进行数次传代的增殖。该类细胞可从解离的组织或组织的部分直接获得。传代的次数高度依赖于所选动物种类，组织来源，供体器官的年龄，等。大多情形下，体外观察到细胞增殖逐步变缓，然后停止增殖。 

该静息常与复制衰老相应，称为海弗利克极限。该静息被认为是真分子钟活动的结果，其中端粒的长度被认为是一种关键组分。端粒是位于染色体末端的重复序列。重复核苷酸结构变短是DNA半保留模式复制的结果。当控制在染色体末端添加重复序列的端粒酶缺乏时，随着端粒的大小，细胞到达一个非回复性的点，过该点时，一种至今未知的活化控制细胞周期相关基因的分子机制启动。细胞被认为阻断在G1分裂期且停止增殖。在细胞周期的负调控中涉及多种因素，如各种周期蛋白，特定激酶，RB和p53蛋白，特定转录因子，如E2F和其他多种因子(mdm2，BTG，p21，等)。相反，端粒酶被看作是细胞永生化的中心因素，因为它维持端粒的长度且使细胞对于因连续分裂造成的丢失不敏感。 

在发育的器官中及器官的生命期，仅一些细胞，包括某些淋巴细胞，显示出端粒酶的永久表达。这种活性也正是干细胞的一种特性，无论在成体(SSC)水平还是幼体发生水平。这种端粒酶活性的表达、维持表达及“唤醒的”表达的特征也是与体外维持生长细胞的永生化特点相联系的。至今，许多癌细胞也检测出端粒酶活性呈阳性。该活性被认为是造成肿瘤细胞在体内具有不受控的增殖能力的原因。 

所有情况下，端粒酶活性都是干细胞特征、生殖系谱系及细胞成为永生化的能力的极好标记。因而，使用两个标准：端粒酶活性和端粒长度。 

在相对于许多实验室中流程和结果都已很有效而要全面而很简洁的建立过程中，细胞系的建立将按两种途径进行：一种由非诱导性的内在遗传性损伤导致的自发式建立，以及一种通过病毒，逆转录病毒 或其他方法如化学试剂，辐射，UV(紫外线)照射，等诱导的触发式建立。在哺乳动物中，例如，啮齿类动物(大鼠，小鼠，等)细胞系的建立认为是非常容易的自发性的；而另一方面，不考虑组织来源的人细胞系建立的情形就很不相同(Smith和Pereira-Smith，1996)。 

因此，当非常想从上述禽干细胞中获得细胞系而用于在体外大量生产目的物质时，问题就在于能否在经济的培养基中维持细胞培养而避免如细胞分化和衰老的障碍。