[发明专利]一种适用于底泥中微生物群落结构分析的DNA提取方法

权利要求书

1.一种底泥中微生物群落结构分析的DNA提取方法，其特征在于提取步骤为：称取0.5g湿重的底泥样品置于5mL灭菌后的离心管中，加入3mLTENP buffer，所述TENP buffer的配方为50mM Tris，200mM EDTA，100mM NaCl，0.01g/mL PVPP，pH10.0，漩涡振荡8min，10000rpm离心5min，弃上清，在沉淀中再加3mL TENP buffer，按上述方法再洗涤两次，最后加3mL的PBS buffer，所述PBS buffer配方为8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na₂HPO₄，0.24g KH₂PO₄，溶于1L水中，pH7.4；将预处理之后的沉积物样品置于-80℃和65℃反复冻融三次，向样品中加入溶菌酶，溶菌酶的终浓度为1mg/mL，在37℃水浴1h；向样品中加入蛋白酶K和十二烷基磺酸钠，蛋白酶K的终浓度为0.2mg/mL，十二烷基磺酸钠的终浓度为1％，在55℃水浴1.5h，每10～15min轻轻倒置离心管几次，混匀；样品在室温下10000rpm离心5min，取出500μL上清液置于一新离心管中，向其中加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇混合液，酚∶氯仿∶异戊醇的体积比为25∶24∶1，轻轻振荡、混匀；室温下14000rpm离心25min，取出400μL水相置于一新离心管中，加入等体积的氯仿∶异戊醇混合液，氯仿∶异戊醇的体积比为24∶1；室温下14000rpm离心25min，取出300μL水相置于一新离心管中，加入200μL预冷的异丙醇，在-20℃沉淀2h；在4℃条件下，14000rpm离心25min，去上清，向沉淀中加入1mL 70％浓度的冷乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心10min，去乙醇，再用同样方法洗涤沉淀两次；倒掉乙醇，在空气中自然风干，用50μLTE缓冲液溶解DNA，保存于-20℃，所述TE缓冲液配方为10mM Tris-HCl，1mMEDTA，pH8.0。