[发明专利]一种适用于底泥中微生物群落结构分析的DNA提取方法

说明书

技术领域

本发明属于环境微生物生态学技术领域，具体涉及一种适用于底泥中微生物 群落结构分析的DNA提取方法。

背景技术

河流或湖泊中的底泥是生态系统的重要组成部分，也是大量微生物类群的栖 息地，这些微生物类群在湖泊进化演替以及营养元素循环等方面发挥着重要的作 用。当前，有关底泥中的微生物群落结构组成的研究已成为微生物生态学研究中 的热点领域。但是，由于自然界中存在的许多微生物不可培养，依靠传统的显微 镜观察和分离培养来研究微生物的方法难以快速、全面的对湖泊沉积物中的微生 物进行研究。近年来，随着分子生物学技术的发展，产生了一些新的微生物生态 学研究方法，如：自动核糖体基因间隙分析(Automated ribosomal intergenic spacer analysis，ARISA)，变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)以及末端限制性片段长度多态性(Terminal restriction fragment length polymorphisms，T-RFLP)等，这些方法的共同之处是突破了原 有的微生物分离培养的过程限制，能够更加全面的分析自然界中存在的各种微生 物。另外，这些基于核酸的分子生物学技术一般需要先从底泥中提取出DNA，然 后再进行进一步的分子生物学研究。因此，DNA提取质量的好坏，会直接影响到 微生物群落结构的分析结果。通常底泥成分复杂，难以直接提取到高浓度、高质 量的DNA。另外，底泥中包含的腐质酸、重金属等物质会干扰后续的PCR反 应，必须在DNA提取阶段予以去除。目前大多数学者使用的DNA提取方法有的 无法有效去除底泥中的腐质酸等干扰物质，给后续的PCR扩增带来困难，有的需 要使用高成本的核酸吸附柱。因此，探索简便、高效、低成本的DNA提取方法 仍然是微生物生态学研究所面临的难题。

发明内容

技术问题：本发明提供了一种从底泥中提取DNA的简便、高效的方法，可 直接用于底泥中微生物群落结构的分析。

技术方案：一种底泥中微生物群落结构分析的DNA提取方法，提取步骤 为：

a.用TENP buffer清洗底泥样品，将清洗好的底泥样品悬浮于PBS buffer中；

b.将经步骤a预处理的底泥样品在-80℃和65℃反复冻溶后加入溶菌 酶，在37℃水浴1h，所述溶菌酶最终浓度为1mg/mL；

c.向底泥样品中加入蛋白酶K和十二烷基磺酸钠，在55℃水浴1.5h， 所述蛋白酶K最终浓度为0.2mg/mL，所述十二烷基磺酸钠最终浓度 为1％(w/v)；

d.步骤c所得样品在室温下离心后取上清液，向其中加入等体积的酚∶ 氯仿∶异戊醇混合液，振荡混匀，所述混合液中各物质的体积比为 25∶24∶1；

e.步骤d所得样品室温下离心后取液相，向液相中加入等体积的氯仿∶ 异戊醇混合液，混合液中氯仿∶异戊醇的体积比为24∶1；

f.步骤e所得样品室温下离心后取液相，向液相中加入预冷的异丙醇 在-20℃沉淀2h；

g.步骤f所得样品在4℃条件下离心去上清，向沉淀中加入预冷的乙醇 洗涤沉淀三次，再离心去乙醇；

h.将样品在空气中自然风干，用TE缓冲液溶解DNA保存于-20℃。