[发明专利]快速简易筛选多环芳烃降解菌的双层平板方法及其筛选平板

权利要求书

1、一种从环境样品中快速简易筛选多环芳烃降解菌的双层平板方法，其特征在于，步骤如下：

(1).土壤样品的采集：

采集多环芳烃污染土壤，保存；

(2).多环芳烃降解菌的富集：

在以多环芳烃为唯一碳源的无机盐液体培养基中加入污染土壤，避光摇床培养；每隔数天转接培养液至新鲜的以多环芳烃为唯一碳源的无机盐液体培养基中富集培养；

(3).多环芳烃降解菌的初筛：

利用双层平板进行多环芳烃降解菌的初筛，双层平板下层为无机盐固体培养基，上层为以多环芳烃为唯一碳源的无机盐固体培养基；将步骤(2)得到的富集培养液做梯度稀释，涂布于双层平板培养，挑取在菌落周围形成透明水解圈的菌落接种于另一双层平板做划线分离，最终纯化出单菌落；

(4).多环芳烃降解菌的复筛：

(4)-1.将初筛菌株接种于Luria-Bertani培养基中，培养至OD600约为0.6，离心去上清，用无机盐液体培养基洗涤并悬浮菌体；

(4)-2.吸取菌悬液接入装有以多环芳烃为唯一碳源的无机盐液体培养基中，三角瓶中预先加入多环芳烃丙酮溶液，振荡使丙酮溶液完全挥发，培养基中多环芳烃终浓度为100mg/L；

(4)-3.避光摇床培养14天；

(4)-4.瓶内残留多环芳烃经萃取后，采用高效液相色谱测定残留量，选取降解率高的菌株作为高效降解菌。

2、根据权利要求1所述的从环境样品中快速简易筛选多环芳烃降解菌的双层平板方法，其特征在于，各步骤具体操作如下：

(1).土壤样品的采集：

所述的采集多环芳烃污染土壤，是指采集0～20cm深度的多环芳烃污染土壤；

所述的保存是在4℃保存；

(2).多环芳烃降解菌的富集：

在以多环芳烃为唯一碳源的无机盐液体培养基中加入污染土壤，避光摇床培养；每隔数天转接培养液至新鲜的以多环芳烃为唯一碳源的无机盐液体培养基中富集培养；

所述避光摇床培养的操作是；在灭菌三角瓶中加入10mg/mL的多环芳烃丙酮溶液500μL，30℃振荡使丙酮完全挥发，再加入50mL无机盐液体培养基，制成以多环芳烃为唯一碳源的无机盐液体培养基，多环芳烃终浓度为100mg/L；在该液体培养基中加入5g污染土壤，30℃ 200rpm避光摇床培养；

所述的富集培养是：每隔一周按10％接种量转接培养液至新鲜的以多环芳烃为唯一碳源的无机盐液体培养基中富集培养，连续富集4轮；

(3).多环芳烃降解菌的初筛

所述的将将步骤(2)得到的富集培养液做梯度稀释，涂布于双层平板培养，是指：在30℃培养7～14天；

所述的挑取在菌落周围形成透明水解圈的菌落接种于双层平板做划线分离，是指：在30℃培养2周以上，最终纯化出单菌落；

(4).多环芳烃降解菌的复筛

所述步骤(4)-1.的操作是：将初筛菌株接种于50mL Luria-Bertani培养基中，培养4～5天至OD600约为0.6，离心去上清，用无机盐液体培养基洗涤菌体2次，最后用50mL无机盐液体培养基重新悬浮菌体；

所述步骤(4)-2.的操作是：吸取5mL菌悬液接入装有45mL以多环芳烃为唯一碳源的无机盐液体培养基中，三角瓶中预先加入10mg/mL的多环芳烃丙酮溶液500μL，30℃振荡使丙酮溶液完全挥发，培养基中多环芳烃终浓度为100mg/L；

所述步骤(4)-3.的避光摇床培养14天，是指：在30℃ 200rpm避光摇床培养14天；

所述步骤(4)-4.的选取降解率高的菌株作为高效降解菌，是指：瓶内残留多环芳烃经萃取后，采用高效液相色谱HPLC测定，选取降解率高的菌株作为高效降解菌。

3、根据权利要求1所述的从环境样品中快速简易筛选多环芳烃降解菌的双层平板方法，其特征在于，步骤(3)中，所述双层平板制备方法是：先在平板中倒入无机盐固体培养基约15mL，待其完全凝固；再趁热吸取4mL以多环芳烃为唯一碳源的无机盐固体培养基覆于下层培养基上面，轻摇平板使上层培养基平铺均匀，静置凝固。