[发明专利]快速简易筛选多环芳烃降解菌的双层平板方法及其筛选平板

说明书

技术领域

本发明涉及一种从环境样品中筛选菌株的方法，具体涉及一种从环境样品中快速简易筛选多环芳烃降解菌的双层平板方法。本发明还涉及该方法所使用的筛选平板。

背景技术

多环芳烃是一类在环境中广泛存在的有机污染物，许多种类都具有致癌、致畸、致突变的“三致”效应。上世纪80年代初，美国环保署便将其中16种PAHs列为优先控制污染物。环境中多环芳烃的主要消除方式是通过微生物降解，所以筛选出高效降解菌是对这种污染物进行生物修复的关键步骤。

多环芳烃的水溶性很低(如芘的水溶性仅为0.077mg/L)，无法直接在无机盐培养基内引入多环芳烃作为唯一碳源。所以传统筛选方法是先将污染样品中的所有可培养细菌都进行分离纯化，再逐个验证每株细菌的降解能力，这种筛选方法工作强度大、筛选效率低，且易忽略生长较为缓慢的目标菌。基于此，随后发展出几种以多环芳烃为唯一碳源的平板筛选法，其中包括喷雾法、平板升华法，它们都能直接通过肉眼识别多环芳烃水解圈而筛选出降解菌。

喷雾法是先将多环芳烃溶解在有机溶剂中，再喷雾方式将其喷洒在无机盐固体培养平板上，待有机溶剂挥发之后便形成一层多环芳烃膜。由于多环芳烃膜形成之后再划线接菌会破坏多环芳烃膜，所以在降解菌分离纯化时候往往是先接菌再制备多环芳烃膜。但是先接菌后再喷雾的操作会由于喷雾时携带的高浓度有机溶剂对已接的菌造成一定的损伤；此外，喷雾平板的制作过程会对环境空气造成较大的多环芳烃污染。

平板升华法则是利用升华冷却的方法设计的，具体步骤为先将菌接种至无机盐固体平板，然后再把接种后的平板倒扣底部平铺有多环芳烃的烧杯上，并用封口膜将接口处封闭，整体放到沙浴中加热，并在平板上方放上冰。多环芳烃在一定温度下升华，遇到冷平板会冷却而附着于平板上形成多环芳烃膜。平板升华法的主要缺点是制作过程相对比较复杂，不利于大量制作。

上述两种方法都是在无机盐平板上形成多环芳烃膜，基于划线接菌会破坏多环芳烃膜的原因，两种方法在菌的分离纯化时往往是先接菌再制膜，在制备过程中还应考虑无菌操作，操作相对较为麻烦。此外，两种方法所形成多环芳烃膜是无法对多环芳烃污染物的含量进行定量控制的。

发明内容

为了克服现有技术的上述不足，本发明的目的是提供一种从环境样品中快速简易筛选多环芳烃降解菌的双层平板方法。本方法利用以多环芳烃为唯一碳源的无机盐液体培养基对土壤降解菌进行富集培养，采用双层平板对降解菌进行初筛，并结合高效液相色谱法所测降解率确定高效降解菌。双层平板制作过程比较简单，适于大量制作；同时能够对平板中多环芳烃污染物的含量进行定量控制。

完成上述发明任务的方案是：一种从环境样品中快速简易筛选多环芳烃降解菌的双层平板方法，其特征在于，步骤如下：

(1).土壤样品的采集：

采集多环芳烃污染土壤，保存；

(2).多环芳烃降解菌的富集：

在以多环芳烃为唯一碳源的无机盐液体培养基中加入污染土壤，避光摇床培养；每隔数天转接培养液至新鲜的以多环芳烃为唯一碳源的无机盐液体培养基中富集培养；

(3).多环芳烃降解菌的初筛：

利用双层平板(初筛平板)进行多环芳烃降解菌的初筛，双层平板下层为无机盐固体培养基，上层为以多环芳烃为唯一碳源的无机盐固体培养基；将步骤(2)得到的富集培养液做梯度稀释，涂布于双层平板(初筛平板)培养，挑取在菌落周围形成透明水解圈的菌落接种于另一双层平板做划线分离，最终纯化出单菌落；

(4).多环芳烃降解菌的复筛：

(4)-1.将初筛菌株接种于Luria-Bertani培养基中，培养至OD600约为0.6，离心去上清，用无机盐液体培养基洗涤并悬浮菌体；

(4)-2.吸取菌悬液接入装有以多环芳烃为唯一碳源的无机盐液体培养基中，三角瓶中预先加入多环芳烃丙酮溶液，振荡使丙酮溶液完全挥发，培养基中多环芳烃终浓度为100mg/L；

(4)-3.避光摇床培养14天；

(4)-4.瓶内残留多环芳烃经萃取后，选取降解率高的菌株作为高效降解菌。

本发明通过设计一种简易的筛选多环芳烃降解菌的筛选平板，改进了多环芳烃降解菌的筛选方法。双层平板制作过程比较简单，适于大量制作；同时能够对多环芳烃污染物的含量进行定量控制。

对以上技术方案的进一步优化，得到的具体操作步骤是：一种从环境样品中快速简易筛选多环芳烃降解菌的双层平板方法，其特征在于，步骤如下：

(1).土壤样品的采集：