[发明专利]大肠杆菌O157:H7鼠血清抗体胶体金免疫层析检测试纸条

权利要求书

1.一种大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)O157：H7鼠血清抗体胶体金免疫层 析检测试纸条，是由颗粒为20nm的胶体金溶液标记纯化的羊抗鼠IgG制成胶体金垫、 分别用O157：H7抗原和纯化的鼠血清IgG包被的硝酸纤维素膜作为检测线和质控线、 玻璃纤维素膜制成的样品吸收垫、吸水滤纸制成的吸收垫组装成的检测试纸条，其制 备方法为：

1)大肠杆菌O157：H7抗原的制备

培养大肠杆菌O157：H7，3500r/min离心30min，用PBS重悬，0.5％甲醛灭活， PBS洗3次，沉淀重悬于PBS，-20℃冻存备用；

2)免疫胶体金的制备

取20nmpH值为7.0的颗粒胶体金溶液，加入蛋白量为27.5μg/ml的已纯化羊抗 鼠IgG，在室温下搅拌30min，加质量体积比10％牛血清白蛋白BSA使其终浓度为质 量体积比0.4％，室温搅拌5min，加质量体积比10％PEG使PEG终浓度为质量体积 比0.2％，室温搅拌5min；12000r/min离心45min，吸取离心上清，沉淀溶于2ml保 存液中，用0.45μm滤膜过滤，置4℃保存备用，制得胶体金标记抗体原液；保存液 配制方法：0.1g四硼酸钠、0.25g BSA、0.025g NaN₃加水溶解后用6N HCl调pH至7.4， 补水至250ml，用0.45μm滤膜过滤后，4℃保存；

3)金标抗体玻璃纤维素膜的制备

取胶体金标记抗体原液1ml，加入工作液2ml稀释，混匀，均匀地加在玻璃纤维 素膜上，制成金标抗体玻璃纤维素膜，即胶体金垫，37℃干燥，4℃保存备用；工作 液配制方法：6.1g Na₂HPO₄.12H₂O、8.5g NaCl、5.0g PVP40、2.1g硼酸、1.0g PEG4000、 0.5g BSA加水溶解后用6N HCl调pH至7.4，补水至1000ml，用0.45μm滤膜过滤后， 4℃保存；

4)固相硝酸纤维素膜NC的制备

用0.01M pH7.2的PBS分别稀释大肠杆菌O157：H7抗原和纯化的鼠血清IgG， 用蛋白浓度为2.0mg/ml大肠杆菌O157：H7抗原和蛋白浓度为2.0mg/ml纯化鼠血清 IgG点样于NC膜上分别作为检测线和质控线，室温干燥，封闭，层析试验背景清晰；

5)试纸条的组装

在宽2×长9cmPVC底板上(1)，中间段粘贴宽2×长3cm固相硝酸纤维素膜， 即NC膜(2)；靠近固相纤维素膜检测线T线一端的PVC底板表面粘贴2×2cm的胶 体金-羊抗鼠IgG抗体结合物玻璃纤维膜(5)，此玻璃纤维素膜与NC膜(2)重叠0.1cm， 另一端与2×1cm的样品吸收垫(7)重叠0.2cm；靠近固相纤维素膜质控线C线一端 的PVC底板表面黏贴2×3.5cm的吸水滤纸制成的吸收垫(6)，与NC膜重叠0.1cm； 抗体固相硝酸纤维素膜NC膜(2)上划有一条大肠杆菌O157：H7抗原检测线T线(3) 和一条鼠血清IgG质控线C线(4)；

T线划在长3cm×宽2cm NC膜一侧1cm的位置上，将浓度为2.0mg/mL的大肠 杆菌O157：H7抗原装入划膜机，喷涂于NC膜上，另一喷头划质控线C线，浓度为 2.0mg/mL的鼠血清IgG，C线划在NC膜另一侧1cm的位置上，检测线与质控线的 距离为1cm，点样量均为5μl喷在硝酸纤维膜上，组装好的纸板按纵向剪切，裁成宽 度为2.5mm的条状，即为抗体检测试纸条成品。