[发明专利]大肠杆菌O157:H7鼠血清抗体胶体金免疫层析检测试纸条

说明书

一、技术领域

本发明涉及一种大肠杆菌O157:H7鼠血清抗体胶体金免疫层析检测试纸条，属 于抗体检测试剂盒技术域。专用于鼠血清中大肠杆菌O157:H7抗体的快速检测，适用 于动物养殖场、食品生产企业等地区调查与追溯鼠O157:H7感染状况时的现场检测以 及在开展食品安全环境风险评估时使用。

二、背景技术

大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)O157:H7是一种重要的人兽共患病原微生物， 人感染O157:H7可患腹泻、出血性结肠炎(HC)、溶血性尿毒综合征(HUS)及血栓 性血小板减少紫癜(TTP)等严重并发症，严重者可导致死亡(夏兴霞，刘洁，王永 山，诸玉梅，欧阳伟，何孔旺，张雪寒.动物源性人兽共患细菌病防控生物新制剂的 研究：I.分泌抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立.江苏农业学报， 2009，25(2)：291-295)。1982年在美国首次发现，在此后的20多年中，由O157:H7所 致的疾病在全世界范围内都有散发和暴发，1996年曾在日本暴发流行。2001年，在 中国江苏、安徽等地也发生了多次食源性感染O157:H7事件，导致177人死亡，引起 了全社会的广泛关注。O157:H7的感染因具有暴发流行趋势、强烈的致病性与致死性 以及抗生素治疗可能会加剧病情等特点，已成为全球性的公共卫生问题，世界卫生组 织已将O157:H7列为新的食源性病原菌。

食源性以及与带菌动物接触是人感染O157:H7的主要途径，反刍动物是O157:H7 的主要宿主，阳性率0.1％～16％，此外，从鹅、鸡、马、鹿、海鸥、绵羊、山羊、鸽 子、鸭、兔、狗、猫的粪便中也可分离到O157:H7。鼠与食品生产和人类生活关系密 切，在疫病传播中起重要作用，对食品安全和人类健康威胁极大，但至今缺乏有关鼠 感染O157:H7的状况及其流行病学意义的研究资料。

本发明基于我国食品安全的严峻形势和对快速检测试剂盒的迫切需求，运用胶体 金免疫层析技术，制备鼠血清O157:H7抗体胶体金免疫层析检测试纸条，为监测动物 养殖场、食品生产企业等地区鼠O157:H7的感染状况提供简便快速的抗体检测方法， 为开展O157:H7流行病学追溯、调查以及食品安全环境风险评估提供技术支撑。

三、发明内容

技术问题

本发明针对当前我国部分动物养殖场、食品生产企业等地区鼠较多的环境现状， 研制一种简便、快速、并适合于现场使用的监测鼠大肠杆菌O157:H7抗体胶体金免疫 层析检测试纸条，用于O157:H7流行病学调查、追溯以及食品安全环境风险评估。

技术方案本发明的具体实施方案如下：

一种大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)O157:H7鼠血清抗体胶体金免疫层析检 测试纸条，由颗粒为20nm的胶体金溶液标记纯化的羊抗鼠IgG制成胶体金垫、分别 用O157:H7抗原和纯化的鼠血清IgG包被的硝酸纤维素膜作为检测线和质控线、玻 璃纤维素膜制成的样品吸收垫、吸水滤纸制成的吸收垫组装成的检测试纸条、阳性血 清、阴性血清、血清样品稀释液和试纸条使用说明书组成。

上述检测试纸条，其制备方法为：

1)大肠杆菌O157:H7抗原的制备

培养大肠杆菌O157:H7，3500r/min离心30min，用PBS重悬，0.5％甲醛灭活， PBS洗3次，沉淀重悬于PBS，-20℃冻存备用；

2)免疫胶体金的制备

取20nm颗粒胶体金溶液(在波长521nm时的光吸收值为1.847，A₅₂₁＝1.847) 20ml，在磁力搅拌(200r/min)下缓慢加入已纯化的羊抗鼠IgG，在室温下搅拌30min， 加质量体积比10％牛血清白蛋白BSA使其终浓度为质量体积比0.4％，室温搅拌5min， 加质量体积比10％PEG使PEG终浓度为质量体积比0.2％，室温搅拌5min；12000r/min 离心45min，吸取离心上清，沉淀溶于2ml保存液中，用0.45μm滤膜过滤，置4℃保 存备用，制得胶体金标记抗体原液；

3)金标抗体玻璃纤维素膜的制备

取胶体金标记抗体原液1ml，加入工作液2ml稀释，混匀，均匀地加在玻璃纤维 素膜上，制成金标抗体玻璃纤维素膜，即胶体金垫，37℃干燥，4℃保存备用；

4)固相硝酸纤维素膜NC的制备