[发明专利]一种利用拮抗微生物菌剂修复沙门氏菌污染土壤的方法

说明书

一、技术领域

本发明属于土壤污染修复技术中微生物修复领域，特别涉及一种土壤微生物污染中利用拮抗微生物菌剂修复沙门氏菌污染土壤的微生物生态修复方法。

二、背景技术

沙门氏菌(Salmonella)是引起肠道细菌性感染和细菌性食物中毒的重要病原体。在全球范围内，近年来沙门氏菌中毒事件急剧上升，其中许多中毒事件是由于食用了沙门氏菌污染食物和饮用了沙门氏菌污染水而引起的，因而人们对导致食物和水体污染的土壤病原菌污染更加关注。研究表明，大量的未经妥善处理的人、畜、禽粪便施入土壤以及生活、养殖污水排放到土壤环境是增加沙门氏菌污染土壤风险的主要因素，人、畜、禽粪便作为有机肥施加到土壤中不但能够增加沙门氏菌的在土壤中的存活时间，同时土壤中大量存在的沙门氏菌能够增加畜禽养殖业的风险。在4-6℃范围内，土壤中大多数病原菌可存活30天左右，但是沙门氏菌存活时间相对较长。在众多病原菌中，沙门氏菌在20-30℃的土壤中，要比其它病原菌存活时间要长得多。Islam等研究发现沙门氏菌随污灌或畜禽粪便不当使用进入土壤后，203-231天后在土壤样品中仍然可以检测到存活的沙门氏菌，在沙门氏菌污染土壤上播种小萝卜84天和播种红萝卜203天后仍能检测土壤中沙门氏菌的存在。也有文献报道夏季随着畜禽粪便施加到土壤中的沙门氏菌可存活近300天，存活土壤中的沙门氏菌也可随地表径流进入到地表水体中，污染地表水。土壤中的沙门氏菌污染能通过造成食物污染和水源污染而引起人体肠道感染，进而影响公共卫生安全。因此，抑制或杀灭土壤环境中沙门氏菌、修复污染土壤、降低土壤环境中沙门氏菌存活数量，对于减少沙门氏菌感染性疾病的爆发和蔓延具有重要意义。但是国内外尚未有有关对于沙门氏菌污染土壤进行微生物修复的报道。

三、发明内容

发明目的：本发明针对上述技术缺陷，提供一种利用拮抗微生物菌剂修复沙门氏菌污染土壤的方法，该方法运用微生物生态学原理，利用自土壤中分离筛选的沙门氏菌拮抗菌的抑制或杀灭作用对沙门氏菌污染土壤进行原位微生物修复，既避免了物理修复对土壤结构和土壤生物的损害，又避免了化学修复可能导致的二次污染。

技术方案：本发明的技术解决方案为：一种利用拮抗微生物菌剂原位修复沙门氏菌污染土壤的微生物生态学方法，方法步骤为：利用无菌滤纸片平板法从被沙门氏菌污染的土壤中分离得到适宜于土壤环境、对沙门氏菌有抑制或杀灭作用的拮抗细菌；拮抗微生物菌株经过如下流程进行发酵：种子液接种→一级培养→二级培养接种→二级扩大培养，得到拮抗细菌菌液；拮抗细菌菌液喷施于沙门氏菌污染土壤，喷施后耙匀。

沙门氏菌污染土壤拮抗微生物原位修复方法，方法步骤为：在LB细菌培养基平板上，首先均匀涂布病原菌接种液，然后用灭过菌圆形滤纸片分别蘸取目标拮抗细菌培养液，贴在涂过病原菌的平板上，于培养箱中28℃条件下培养1-3天，挑选具有明显抑菌圈菌株，对该菌进行记录，保存；拮抗微生物复合菌剂制备：用无菌接种环将斜面保存菌种，接种至三角瓶无菌液体培养基中摇匀即成菌悬液，30℃，200r/min培养24h，培养得到一级种子液；将一级种子液按其与发酵培养基体积比1∶10的接种量接种到发酵瓶中二级扩大培养48h得到发酵液；利用微生物复合菌剂对沙门氏菌污染土壤进行微生物修复，分对照和添加拮抗微生物复合菌剂2个处理布置土培试验，置于自然条件下培养，添加拮抗微生物复合菌剂处理和对照均设4个重复，定期采取土样测定土壤中沙门氏菌存活数量，监测污染土壤中沙门氏菌的数量动态变化；根据温室土培微生物菌剂修复效果，应用微生物修复方法于田间沙门氏菌污染土壤进行拮抗微生物复合菌剂微生物原位修复，将发酵培养拮抗微生物菌液施加到沙门氏菌污染田间土壤中，每个对照和处理设3个重复，于施加拮抗微生物复合菌剂后定期采集污染土壤0-10cm表层土样，采用五点采样法，监测污染土壤中的沙门氏菌的数量动态变化，以监测是否达到治理沙门氏菌污染土壤的效果。