[发明专利]一种氯霉素的光激化学发光免疫分析试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

一种氯霉素的光激化学发光免疫分析试剂盒及其检测方法，属于光激化学发光免疫分析(LICLIA)技术领域，用于食品中CAP含量的检测。

背景技术

氯霉素(Chloramphenicol，CAP)是一种廉价高效的广谱抗生素，对革兰氏阳性和阴性细菌都有很好的抑制作用，因此一度被广泛应用于农牧业中。但是动物源性食品随着食物链被人体长期摄入，可引发多种疾病。轻者破坏人体内正常菌群的平衡状态，菌群失调，使人体产生耐药菌珠，给今后患病使用抗生素治疗带来不良影响；抗生素过敏体质的人会出现过敏反应，危及健康。严重时可干扰骨髓细胞蛋白质的合成，并抑制幼稚细胞DNA合成，导致粒细胞减少，引发再生障碍性贫血、溶血、紫癜等恶性疾病。

鉴于CAP的毒副作用，国际食品学界将其列为禁药，欧盟、美国等均在法规中规定CAP残留限量标准为“零容许量”(Zerotolerance)，即不得检出，根据欧盟“2002/657/EC”标准规定，动物源性食物中CAP的最小要求检出极限是0.3μg/kg。不久美国FDA也做出相应的规定。我国农业部规定了CAP在所有食品动物的可食用组织中不得检出，并将其从《中国兽药典》中删除，列为禁药。并相应制定了SN0219-93和SCT3018-2004行业标准，与国际接轨。

为适应更高的检测标准，检测技术水平必须相应的提高，近十年CAP检测技术一直是国际专家学者研究的热门项目之一。CAP的检测方法分为物理化学法和免疫化学法，前者有液相色谱法(LC)、高效液相色谱法(HPLC)、质谱法(MS)等，后者主要是酶免法(ELISA)，检测的灵敏度均达到ppb(μg/kg)级别。当前主流的检测方法是LC——我国行业标准所使用的方法，以及ELISA。近几年，国内外学者又研发出液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)、液相色谱电喷雾电离质谱法(LC-EITMS)、微生物分析等物理检测新方法，对ELISA方法的应用也有了进一步研究。

光激化学发光免疫分析(LICLIA)是以纳米级高分子微粒为基础的新一代化学发光免疫技术，又称为AlphaLISA分析法，该项技术将被广泛地应用于研究生物分子的相互作用。其主要原理是由光激发产生的均相化学发光技术，它具有快速、均相(免洗)、高灵敏、量程宽和操作简便的特点。LICLIA试剂由含有感光化合物的感光微粒和含有发光化合物的发光微粒组成，微粒直径约188nm，表面覆盖多糖水凝胶。水凝胶能减少非特异性结合，同时增加微粒的悬浮性。微粒通过水凝胶表面的功能团与生物分子共价连接。纳米级微粒大大增加了反应的表面积，每个微粒表面覆盖成百上千个生物分子，可捕获目标分子。

LICLIA技术的核心原理是单线态氧的产生和传递。在受到红色激光(680nm)照射后，感光微粒能使周围环境中的氧转化为单线态氧，单线态氧的生存时间仅为4微秒。短暂的生存时间决定了单线态氧的传播直径很小(约为200nm)。当发光微粒在200nm范围之内就能接受单线态氧，并发出高能级的光(520nm-620nm)。相反，如果在200nm直径范围内没有发光微粒，单线态氧就会回落到基态氧而没有信号产生。这种依赖于两种微粒相互接近的化学能量传递是LICLIA均相反应的基础。通常在该反应体系中，微粒的浓度是很低的。两种微粒相互随机碰撞的几率很低，因此，反应体系的本底非常微弱。如果包被在微粒表面的生物分子相互作用，拉近了两个微粒的距离，例如形成免疫夹心或受体-配体复合物，这样就能产生能量的有效传递并发出光信号。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测CAP的试剂盒及其检测方法，用于对蜂蜜等产品中CAP含量的检测。

本发明主要采用光激化学发光免疫分析法(LICLIA)检测CAP。其技术方案：一种氯霉素CAP的光激化学发光免疫分析试剂盒，由(1)白色不透明微孔板，(2)CAP标准品，(3)包被有CAP-OVA的发光微粒，(4)兔抗CAP的抗体冻干品，(5)生物素化羊抗兔抗体冻干品和(6)包被有链霉亲和素的感光微粒六件物品组成。

包被有CAP-OVA的发光微粒(3)的制备：在离心管中加入1mg发光微粒，加入12.5μL 1％Tween-20，0.05mg CAP-OVA人工抗原，10μL硼氢化氰钠，用0.1M、pH 6.0的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液将体积补充到200μL，37℃避光振荡反应48小时，加入10μL 0.3M、pH 5.0的羧甲氧基胺半盐酸盐溶液封闭未结合位点，37℃避光孵育1小时，离心纯化，洗去未反应的试剂后，分离得到包被有CAP-OVA的发光微粒，稀释后备用。