[发明专利]传染性法氏囊病病毒变异株VP2基因病毒样颗粒重组蛋白

权利要求书

1、传染性法氏囊病病毒变异株AH1 VP2基因病毒样颗粒重组蛋白，是通过构建重组杆状病毒表达质粒pBac-VP2，用pBac-VP2转染Sf9昆虫细胞获得的重组杆状病毒vBac-VP2表达获得的。

2、根据权利要求1所述的传染性法氏囊病病毒变异株VP2基因病毒样颗粒重组蛋白，其重组杆状病毒表达质粒pBac-VP2和重组杆状病毒vBac-VP2的构建方法为：根据VP2基因序列和供体质粒pFastBacHTA表达阅读框设计VP2基因扩增引物：

正向VP2F(36)：5’-CAGATCTGAATTCATGGCGAACCTGCAAGATCAAAC-3’

反向VP2R(34)：5’-CTACTACCTCCTTATGGCCCGGATTATGTCTTTG-3’

重组杆状病毒表达质粒鉴定引物M13F(17)：

上游序列：5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’

下游序列：5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’

将克隆质粒pUC-VP2(AH1)和含有6个组氨酸His的供体质粒pFastBacHTA分别用EcoR I和Hind III双酶切，将IBDV变异株AH1的VP2基因，定向克隆入杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBacHTA中，构建重组供体质粒pFastBacHTA-VP2，转化含有Bacmid和Helper plasmid的E.coli DH10Bac感受态，用VP2基因正向扩增引物VP2F(36)和M13 R(17)引物下游序列PCR鉴定Bacmid DNA，可得一条大小为2100bp的条带，获得含VP2基因的重组杆状病毒表达质粒pBac-VP2，用pBac-VP2转染Sf9昆虫细胞，获得重组杆状病毒vBac-VP2。

3、根据权利要求1或2所述的传染性法氏囊病病毒变异株VP2基因病毒样颗粒重组蛋白，其特征在于，所述重组杆状病毒表达质粒pBac-VP2和重组杆状病毒vBac-VP2含有6个组氨酸His标签和烟草蚀纹病毒TEV蛋白酶识别位点，便于重组VP2蛋白的纯化。

4、权利要求1-3之一所述传染性法氏囊病病毒变异株VP2基因病毒样颗粒重组蛋白的应用。

5、权利要求1-3之一所述传染性法氏囊病病毒变异株VP2基因病毒样颗粒重组蛋白的纯化方法，包括：用第3代重组杆状病毒vBac-VP2感染Sf9昆虫细胞，待细胞完全病变之后，收集细胞培养物，3000rpm离心30min收集细胞，用HisTrap HP结合缓冲液重悬，并加入20μl 100mmol/L PMSF，置于0℃冰水浴，超声功率500～600W、每次超声时间10min、重复2～4次超声，至细胞悬液清亮，4℃，10000rpm离心30min，去除细胞碎片，取上清用0.45μm孔径滤膜过滤，然后按照说明书用HisTrap HP层析柱纯化重组VP2蛋白。

6、用权利要求1-3之一所述传染性法氏囊病病毒变异株VP2基因病毒样颗粒重组蛋白检测IBDV血清抗体的ELISA方法，包括：用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释纯化的重组VP2蛋白至5μg/ml，包被ELISA板，100μl/孔，4℃过夜；用PBST洗涤3次，每次2分钟，拍干；每孔加入含体积比10％FBS的PBST封闭液300μl，37℃，2h；用PBST洗涤3次，每次2分钟，拍干；加入待检血清样品，37℃，1h；用PBST洗涤3次，每次2分钟，拍干；加入HRP-标记的1∶2000兔抗鸡IgG100μl，37℃，1h；用PBST洗涤4次，每次2分钟，拍干；加入显色剂A液即四甲基联苯胺溶液、B液即过氧化氢脲溶液各一滴，暗盒显色；2M H₂SO₄终止，测A₄₅₀值。

7、权利要求1-3之一所述传染性法氏囊病病毒变异株VP2基因病毒样颗粒重组蛋白的病毒样颗粒基因工程疫苗，其制备方法为：取重组杆状病毒vBac-VP2感染的Sf9昆虫细胞培养物，冻融三次，用IBDV抗体夹心ELISA检测，ELISA效价≥1600，加等体积的白油免疫佐剂，混合乳化，即为IBD病毒样颗粒基因工程疫苗。

8、权利要求7所述病毒样颗粒基因工程疫苗的应用。