[发明专利]传染性法氏囊病病毒变异株VP2基因病毒样颗粒重组蛋白

说明书

一、技术领域

本发明涉及传染性法氏囊病病毒(IBDV)变异株(AH1)VP2基因病毒样颗粒重组蛋白的表达与应用，属于生物制药领域。

二、背景技术

传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease，IBD)是引起我国及世界养禽业严重经济损失的主要传染病之一，是由传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的以侵害雏鸡淋巴组织，特别是中枢免疫器官-法氏囊为主要特征的传染病。该病的危害包括两个方面：一是引起3～8周龄的鸡发病和死亡，尤其是近年来超强毒株(vvIBDV)的出现使雏鸡死亡率大大增加；二是雏鸡早期感染本病，则引起免疫抑制，导致鸡群对其它疫病的易感性增高和对疫苗的免疫应答能力降低或失败，造成巨大的间接经济损失。

疫苗接种是预防该病最有效的方法，在上世纪80年代的中后期，在世界范围内爆发了在抗原性和致病性等方面与经典毒株有很大差异的IBDV变异毒株，使养鸡业遭受重创。变异株和超强毒株(vvIBDV)的出现使该病的防控难度加大，IBD免疫预防失败已成为禽病防控中的重要问题[王永山等.近期引起免疫失败的传染性法氏囊病病毒VP2基因的分子特征.中国兽医科学，2008，38(12)：1013-1019]。目前，使用的常规弱毒疫苗和灭活疫苗，其安全性和制造工艺仍存在不足：为预防变异毒株而采用中强毒力活疫苗存在着较大的生物安全问题，因为在不同IBDV毒株之间潜在着基因重配的可能，给该病的防控带来隐患，灭活疫苗存在着抗原制备的困难。因此，在当前IBD防控实际工作中，亟需免疫效力强、生物安全性高、并且针对当前流行毒株的新型IBD基因工程疫苗的问世。

IBDV属双RNA病毒科双RNA病毒属，基因组包括大(A)小(B)两个片段，有五种病毒蛋白：VP1、VP2、VP3、VP4和VP5。VP2占病毒蛋白的51％，既是IBDV的主要结构蛋白，又是病毒的主要保护性抗原，与病毒中和抗体的诱导、抗原和毒力的变异以及细胞凋亡的诱导等有关。VP2的高变区是病毒中和性单抗的结合必需区，该区的点突变是IBDV抗原漂移、毒力变异并进而造成经典疫苗株免疫失败的主要原因。迄今，IBD基因工程疫苗研究均以VP2为靶基因，采用的表达系统包括：大肠杆菌、酵母、鸡痘病毒载体、杆状病毒表达载体、核酸疫苗以及近期报道的多表位疫苗等。目前IBD基因工程疫苗研究中的主要问题：或者是重组IBDV蛋白的表达量不够高，或者是重组IBDV蛋白复性难度大，或者是源于一种毒株的重组蛋白不适用于其它变异毒株。因此，在VP2基因选择、表达系统以及表达策略方面进一步探索新的技术路线是十分必要的。

三、发明内容

技术问题

本发明针对IBD流行现状和基因工程疫苗研究中存在的主要问题，采用新的技术路线，在目的基因选择上，采用近期引起免疫失败的IBDV变异株(AH1)，该变异株具有完全的IBDV强毒分子特征的VP2基因，该VP2基因与当前预防使用的疫苗毒株(B87株)的VP2基因序列有较大差异，在表达系统上，利用杆状病毒表达系统具有与高等细胞类似的翻译后修饰系统，可使外源基因表达产物具有天然的活性形式以及表达产物可自组装成病毒样颗粒(VLP)的优点，制备病毒样颗粒重组VP2蛋白，研制针对当前IBDV流行毒株的新型高效IBD病毒样颗粒基因工程疫苗和检测试剂。

技术方案

传染性法氏囊病病毒变异株(AH1)VP2基因病毒样颗粒重组蛋白，是通过构建重组杆状病毒表达质粒pBac-VP2，用pBac-VP2转染Sf9昆虫细胞获得的重组杆状病毒vBac-VP2表达获得的。

其重组杆状病毒表达质粒pBac-VP2和重组杆状病毒vBac-VP2，其构建方法为：根据VP2基因序列和供体质粒pFastBacHTA表达阅读框设计VP2基因扩增引物：

正向VP2F(36)：5’-CAGATCTGAATTCATGGCGAACCTGCAAGATCAAAC-3’

反向VP2R(34)：5’-CTACTACCTCCTTATGGCCCGGATTATGTCTTTG-3’

重组杆状病毒表达质粒鉴定引物M13F(17)：

上游序列：5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’

下游序列：5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’