[发明专利]重组细胞致死性扩张毒素CdtB、其表达载体及其制备方法

权利要求书

1.重组细胞致死性扩张毒素cdtB的制备方法，其特征在于制备步骤为：

a.目的基因cdtB的合成：

设计上游引物5’-CCGCTCGAGATGCAATGGGTAAAGCAATT-3’，

带限制性内切酶Xho I酶切位点，下游引物5’- CGCGGATCCTTAGCGATCATGAACAAAACT-3’，带限制性内切酶 BamH I酶切位点；分别以伴放线放线杆菌ATCC 29522、29523为模 板，PCR扩增cdtB基因，PCR条件是94℃，30s，55℃，30s，72℃， 1min，共30个循环，72℃延伸8min，PCR产物长度为：852bp； b.双酶切cdtB基因与带有6×His标签的载体pET-15b，连接构建重 组载体pET-15b-cdtB，转化宿主菌，构建cdtB基因工程菌，所述双酶切 采用的是BamH I和Xho I，所述宿主菌为大肠杆菌；

c.培养cdtB基因工程菌，体外诱导表达CdtB蛋白，以包涵体形式存 在，清洗、溶解包涵体得到包涵体溶解液：所述培养cdtB基因工程菌为 LB培养基，培养温度为37℃；所述体外诱导CdtB蛋白表达使用大肠杆 菌BL21-DE3，终浓度为0.1M的IPTG，诱导4h，温度为37℃；所述 清洗、溶解包涵体是将工程菌超声破碎，离心收集沉淀，用溶液1、2清 洗，溶液3溶解，溶液4析出蛋白，所述溶液1为2M尿素、1wt％ Triton X-100，所述溶液2为2M尿素，所述溶液3为8M尿素、 0.1MβME，所述溶液4为PBS缓冲液；

d.纯化包涵体：所述纯化包涵体是使用Ni-HisTrap HP预装柱纯化， 纯化过程中使用吸附缓冲液和洗脱缓冲液，利用Ni离子良好的螯合性 能，吸附带6×His标签的CdtB蛋白，吸附条件为pH7.4；所述吸附缓 冲液含有8M尿素、20mM磷酸钠和0.5M氯化钠，所述洗脱缓冲液含有 8M尿素、20mM磷酸钠、0.5M氯化钠和500mM咪唑；

e.复性：所述复性采用透析法，形成浓度梯度降低变性剂尿素的浓度 由原始浓度8M降至0M，透析液含有：pH 8.0-9.020mMTris-HCl、5g精 氨酸和1g还原型谷胱甘肽，采用半透膜透析；

f.超滤得到体外重组的CdtB活性蛋白：所述超滤为采用孔径0.2μM 一次性滤膜超滤，-80℃冻存。