[发明专利]重组细胞致死性扩张毒素CdtB、其表达载体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地说涉及一种重组cdtB新序列原核表达载体 构建及其蛋白纯化、复性方法。

背景技术

CdtB是细胞致死性扩张毒素(cytolethal distending toxin，CDT)家族的一个 成员，细胞致死性扩张毒素是一种新近发现的、由伴放线放线杆菌( Actinobacillus actinomycetemcomitans，Aa)产生的细胞毒性因子之一。

伴放线放线杆菌(Aa)是侵袭性牙周炎的主要致病菌之一，在各型牙周炎中尤 以侵袭性牙周炎为最重，此型牙周炎具有发病年龄早、病变进展快、易造成牙周 组织迅速破坏而导致牙齿松动脱落等特点，而且有明显的家族聚集性，对于牙周 炎病因学的研究确认细菌是牙周炎发生的始动因子，而伴放线放线杆菌(Aa)作 为局限型侵袭性牙周炎(Localized aggressive periodontitis，LAgP)的主要致病 菌，可产生一系列毒力因子使其易于定植、破坏宿主组织、抑制组织修复和干扰 宿主免疫防御功能，对疾病的发生发展意义重大。细胞致死性扩张毒素(CDT) 是新近被发现的由G-致病菌产生的一种毒素，该毒素能使中国仓鼠卵巢细胞 (china hamster ovary cell，CHO)停留在G2/M期而不能进入分裂期，从而导致细胞 膨胀、死亡，故命名为细胞致死性扩张毒素，而Aa是迄今被发现的可产生CDT 的唯一的牙周可疑致病菌。

细胞致死性扩张毒素是一种热不稳定蛋白，经研究证实由三个相邻基因编码 cdtA，cdtB，cdtC，对应的蛋白质为CdtA，CdtB，CdtC，分子量近似为28， 32，20kDa组成异源三聚体全毒素。目前已经确认CdtB为毒力亚基。纯化的重 组CdtB蛋白在体外与超螺旋DNA共同作用，可使DNA超螺旋松解或形成DNA 切口。重组CdtB显微注射入细胞内，引起宿主细胞DNA破坏、细胞死亡。 CdtB由CdtA和CdtC转运入细胞内。一旦进入细胞内，CdtB进入细胞核，即可 通过激活DNA损伤依赖的检查点现象，导致DNA破坏和细胞周期停滞。

包涵体由于没有完全正确的天然态结构，不具有生物学活性，必须经体 外分离、纯化、复性等工艺才能变成有生物学活性的产品，据不完全统计显 示，体外表达的蛋白60％以包涵体形式存在，这就使得从包涵体中提取、纯 化及复性重组蛋白的工艺引起高度重视，且直接关系到经济效益。现有的国 内纯化蛋白的工艺存在诸多问题：如采用变性剂致使蛋白粘稠度大、操作难 度大，效率低，而国外一般采用昂贵的蛋白表达纯化仪器，如RTS 500 SYSTEM。因此，目前本领域还缺少一条工艺简便、成本低廉、活性好，仅仅 依靠纯手工即可完成的蛋白纯化复性工艺。

发明内容

技术问题：本发明的目的是提供一种能原核表达cdtB基因的原核表达质粒 pET-15b-cdtB构建方法，并经转化大肠杆菌感受态细胞TOP10和BL21(DE3) ，IPTG诱导，体外诱导表达蛋白CdtB，该蛋白有望作为蛋白药物应用于肿瘤等 疾病的治疗。并且本发明是克服现有的包涵体蛋白纯化过程中存在的问题，提供 一种无需昂贵仪器，只需纯手工即可完成，且方法简便、耗时少、成本低、活 性好，产品复性率可达80％以上。

技术方案：重组细胞致死性扩张毒素cdtB，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所 述。

重组细胞致死性扩张毒素cdtB，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所述。

重组细胞致死性扩张毒素cdtB的表达载体pET-15b-cdtB。