[发明专利]一种编码福康普酶的基因及其应用

权利要求书

1.一种编码福康普酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种表达载体，其特征在于：含有权利要求1所述的编码福康普酶的基因。

3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于：所述的表达载体为重组质粒pETFK₂PmtPA。

4.一种宿主细胞，其特征在于：含有权利要求2所述的表达载体。

5.根据权利4所述的宿主细胞，其特征在于：含有重组质粒pETFK₂PmtPA。

6.根据权利4所述的宿主细胞，其特征在于：所述的宿主细胞为生产福康普酶的大肠杆菌工程菌，其大肠杆菌菌株为BL21(DE3)/FK₂PmtPA，其保藏编号为CCTCCNO：M 209139。

7.一种构建权利要求6所述的宿主细胞的方法，其特征在于：它包括以下步骤

(1)构建重组质粒pETFK₂PmtPA：

用PCR方法以质粒pETrtPAm-1为模板扩增出片段A；用PCR方法以全长tPAcDNA为模板扩增出片段B；用限制性内切酶NheI和KpnI分别切割A片段和B片段，再用T4连接酶进行片段连接，构建出重组质粒pETFK₂PmtPA；其中，重组质粒pETFK₂PmtPA上含有如SEQ ID NO：1所述的核苷酸序列；

其中，片段A的5’端为tPA的P区的261-527aa如SEQ ID No：7所示，片段A的3’端为tPA的F区序列如SEQ ID No：8所示，片段B全序列如SEQ ID No：9所示；

其中，片段A和片段B的扩增方法如下：

引物1：5’-GCC TGT GCT AGC GCA CTC TGC CCT GCC ACT GTT G-3’；

引物2：5’-CC TCC TGC GGT ACC TGC GGC CTG-3’；

引物3：5’-GGACA TCG GCT AGC GAG GGA AAC AGT GAC TGC-3’；

引物4：5’-GCTCG GAT GGTACC GCA GGA GGG CAC ATC ACAG-3’；

用pETrtPAm-1cDNA为扩增模板，反应管中加入引物1和引物2，PCR反应条件：94℃5min，之后94℃1min，51℃3min，72℃2min共33个循环，最后72℃10min，用于扩增片段A；另一组用全长tPAcDNA为扩增模板，加引物3和4，用于扩增片段B，PCR反应条件：94℃5min，之后94℃1min，55℃1min，72℃1min共33个循环，最后72℃10min；

(2)扩增重组质粒pETFK₂PmtPA：

将步骤(1)构建的重组质粒pETFK₂PmtPA转化大肠杆菌DH5α，获得大肠杆菌菌株DH5α/FK₂PmtPA；培养大肠杆菌菌株DH5α/FK₂PmtPA，提取重组质粒pETFK₂PmtPA；

(3)制备宿主细胞：

冷CaCl₂法制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞；将重组质粒pETFK₂PmtPA转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，经筛选和鉴定获得工程菌株BL21(DE3)/K₂PmtPA， 即为宿主细胞。

8.根据权利要求7所述的构建权利要求6所述的宿主细胞的方法，其特征在于：步骤(1)中，对构建出的重组质粒pETFK₂PmtPA进行鉴定，包括用单酶切、双酶切对重组质粒进行鉴定正确后再用DNA测序确证。