[发明专利]一种编码福康普酶的基因及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种编码福康普酶的基因及其应用。

背景技术

人tPA是人的组织型纤溶酶原激活剂(tissue type plasminogen activator，tPA)，是一种丝氨酸蛋白酶。它含527个氨基酸，分子量68KD，能把无活性的纤溶酶原激活成为纤溶酶而发挥溶血栓作用，已在临床上用于急性心肌梗塞、脑血栓中风、肺栓塞等溶栓治疗，是目前国际上优良的溶栓药物，具有溶栓快，安全性高，愈后致残率低，对人无抗原性等优点。

tPA主要由血管内皮细胞表达分泌，血浆中浓度很低，约为5ng/mL，半衰期约5分钟，因此从血浆或组织中直接提取tPA不可能用于生产，只能采用基因工程技术进行生产。1987年，美国率先批准第一个基因工程技术生产的rtPA用于临床治疗急性心肌梗塞，商品名为阿克伐司(Activase)，该产品属于全长的原始tPA，属tPA第一代产品，显著缺点是半衰期短(3～6分钟)，活性低，对病人血浆中较高浓度的tPA抑制物PAI无抗性，因而使用剂量极大，每支针含tPA 150～200mg，每支针的价格也十分昂贵。

为了解决原始tPA存在的问题，在tPA结构与功能研究的基础上，研究人员进一步对tPA进行氨基酸缺失和替换变异研究。tPA在结构上可划分为F区(手指区结构域，4-49aa)、E区(生长因子功能域，50-86aa)、K1区(kringle 1，87-175aa)、K2区(kringle2，176-261aa)和P区(蛋白酶区，262-527aa)五个独立的功能结构域(结构域的命名和编号根据基因库Genbank登录号码GI 137119或文献Pennica D.et al.Nature 301：214，1983)。t-PA的各个特定结构域与t-PA各种生物学活性之间的关系已阐明，F区和K2区均能特异性结合于纤维蛋白凝块，K1区与肝脏受体结合有关，P区上含丝氨酸蛋白酶，负责将纤维酶原切割成纤维酶，其上含有tPA活性抑制物PAI的结合位点(aa296-299)。tPA中任何一个区的缺失或变异不影响其它区域的结构和活性，这为tPA的重组、改造(称之为tPA突变体)提供了基础。美国、德国、日本、英国等国家都在研究通过重组和变异改善tPA的性能，并拥有各自的知识产权，如德国宝丽曼(BoehringerMannheim)公司开发的瑞替普酶(Reteplase，rPA)、美国基因泰克(Genentech)公司开发的TNK酶(Tenecteplase)、美国布里斯托尔-迈尔斯普博(Bristol-MyersSpuibb)公司开发的nPA酶(Lanoteplase)、日本卫材(Eisai)筑波研究所开发的孟替普酶(Monteplase)等。瑞替普酶(Reteplase)是一种用大肠杆菌系统表达生产的重组tPA产品，由K2P两个结构区组成，缺失F、E、K1三个区域，含355个氨基酸(Kohnert U，et al.Protein Engineering 5：93，1992，专利号：EP 0 382 174 A1)。其性质与天然tPA分子有了较大改变，稳定性得到提高，半衰期提高至近15分钟，但是与纤维蛋白的亲和力有较大下降，它与纤维蛋白的结合为可逆结合，结合能力大大低于天然tPA，并且瑞替普酶结构中仍含有tPA活性抑制物PAI的结合位点，体外试验显示5IU/mL的PAI-1就能使5ng/ml的瑞替普酶失活。其比活性为5×10⁵IU/mg，使用剂量20～40mg，制剂在2℃保存有效期2年，溶解后稳定性差，出血率高，临床效果差。TNK酶是一种用中国仓鼠细胞(CHO)生产的全长tPA，含527个氨基酸，在三个位置共6个氨基酸发生替换变异，即K1区的Thr103和Asn117分别被Asn和Glu取代，P区的Lys296-His-Arg-Arg299被4个Ala取代。和原始t-PA相比，TNK酶体外抗PAI的活性提高80倍，半衰期延长4倍，在体内活性只有原始tPA的82％，结合纤维蛋白能力保留87％(Keyt.B.A.et al.PNAS、USA、91：3670，1994)。孟替普酶是一种由田鼠肾细胞生产的全长tPA，含527个氨基酸，将E区的Cys84置换为Ser，其作用效果与t-PA相似，激活纤溶酶原的能力在纤维蛋白存在时比纤维蛋白没有时强14.9倍，但其与纤维蛋白结合率约为原始t-PA的1/3，使其对血栓部位特异性有所下降。以上三种tPA突变体均已上市，另外还有一种正待美国食品及药品管理局(FDA)批准的tPA突变体nPA酶(Lanoteplase)，缺失了F、E区，并修饰了K1区的糖基化位点，与原始t-PA相比，其半衰期延长37min，并改善了溶栓活性，但降低了对纤维蛋白的亲和力，而且引起的颅内出血率高于t-PA。尽管各种tPA突变体在不同的方面改善tPA的性能，但第二代重组tPA仍存在着热稳定性差，特异性不高、使用剂量大以及生产成本高的问题。