[发明专利]狗鱼幼鱼弹状病毒实时荧光RT-PCR检测法和试剂盒

权利要求书

1.狗鱼幼鱼弹状病毒(Pike fry rhabdovirus，PFRV)的实时荧光RT-PCR检测方法，所述方法包括利用特异性探针和引物对，以病毒基因组RNA为模板进行实时荧光RT-PCR反应，其特征在于：所述引物对为能扩增出狗鱼幼鱼弹状病毒G基因的基因片段的引物对，并且分别含有Seq ID No.1和Seq ID No.2所示的序列；

Seq ID No.1：5’-AGGCAATCATTCAATTTGGCTAAC-3’

Seq ID No.2：5’-CATTTCCATACATGGTCCCTGTTG-3’

所述探针为能与狗鱼幼鱼弹状病毒G基因位于所述引物对之间的序列相同或互补、且长度为20～40bp的寡核苷酸序列，并且所述探针的5’端和3’端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述探针含有SeqID No.3所示的序列，

Seq ID No.3：5’-CCTAAAAGAGGAATGCGACCAACACATCG-3’。

3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于：所述探针5’端标记的荧光报告基团为HEX，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMRA。

4.根据权利要求1～3任意一项所述的检测方法，其特征在于：所述RT-PCR反应的引物终浓度为0.9～1.1μmol/L，探针终浓度为0.4～0.6μmol/L。

5.根据权利要求1～4任意一项所述的检测方法，其特征在于：所述RT-PCR的反应的退火温度为55℃～60℃。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述RT-PCR的反应条件包括：50℃反转录30min，94℃预变性4min，40个循环：94℃变性15s，60℃退火及收集荧光信号1min。

7.狗鱼幼鱼弹状病毒(Pike fry rhabdovirus，PFRV)的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有能扩增出狗鱼幼鱼弹状病毒G基因的基因片段的引物对，所述引物对分别含有Seq ID No.1和Seq ID No.2所示的序列，

Seq ID No.1：5’-AGGCAATCATTCAATTTGGCTAAC-3’

Seq ID No.2：5’-CATTTCCATACATGGTCCCTGTTG-3’。

8.根据权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒用于实时荧光RT-PCR检测，并且所述试剂盒还含有能与狗鱼幼鱼弹状病毒G基因位于所述引物对之间的序列相同或互补、且长度为20～40bp的寡核苷酸探针，并且所述探针的5’端和3’端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。

9.根据权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于：所述探针含有Seq ID No.3所示的序列，

Seq ID No.3：5’-CCTAAAAGAGGAATGCGACCAACACATCG-3’。

10.根据权利要求9所述的检测试剂盒，其特征在于：所述探针5’端标记的荧光报告基团为HEX，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMRA。