[发明专利]一种利用球孢白僵菌几丁酶基因提高植物抗病性的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。具体地说，涉及利用非植物来源的几丁酶基因提高植 物对病害的抗性，特别是提高棉花对黄萎病的抗性。

技术背景

自从人类开始栽培作物以来，由病原菌引起的作物病害一直是限制农业生产的主要因 素之一。病害每年可造成全世界作物减产15％以上，直接经济损失达300～500亿美元(李 润植等，2001；Osusky等，2000)。此外，病害还引起作物产品品质下降，病原菌产生的 毒素严重危害人体健康。在作物病害综合防治策略中，培育和推广应用抗病品种是最经济 有效的措施。由于病原菌变异迅速，植物抗性资源有限以及常规育种方法耗时费力，所培 育的抗病品种远不能满足生产需要。利用现代生物技术分离、克隆和转化抗性基因，不仅 定向性强、基因型来源丰富，而且不受抗源亲缘关系限制、育种周期短、理论上也不存在 性状的负相关连锁，可对单一性状进行根本改良。此外，将某些抗病基因转入植物中，不 仅可以提高植物对病原真菌致病因子的解毒能力，而且可以提高植物获得性系统抗性能 力。通过这种方法获得的抗病植物，具有抗性不易丧失、抗性基因来源广容易转育等优点 (Cornelissen等，1993)。因此，基因工程技术已成为植物抗病育种的重要途径。

几丁质酶是一种水解酶，广泛存在于植物和微生物中，具有降解几丁质的作用。几丁 质是植物病原真菌中绝大多数真菌细胞壁的主要成分，而植物中还未发现几丁质酶的作用 底物。此外，真菌细胞壁的降解产物还可进一步诱导植物的防御反应(Grison et al.，1996； Velazhahan et al.，2000；Lorito et al.，1998)。因此，几丁质酶基因一直受到人们关注。

作为重要经济作物的棉花是世界上最重要的天然纤维作物。在中国，棉花历来是关系 国计民生的重要物资，我国棉花产业涉及约2亿农村人口的收入，关系到1900万纺织工 人就业和1000多亿美元的出口创汇，对纺织工业乃至整个国民经济发展都具有举足轻重 的作用。但是，棉花黄萎病自1935年传入我国后，对我国棉花生产的危害逐年加重，重 病年份损失皮棉超过40万吨，直接经济损失达60多亿元(陈捷胤等，2005)。黄萎病为 害严重的棉田，可减产70％以上，同时还严重降低纤维品质。棉花黄萎病这一世界性的重 大病害，严重阻碍着我国棉花生产的发展。棉花黄萎病(cotton Verticillium wilt)属土传维 管束病害，其特点是分布广、危害重、寄主范围广、传播途径多、存活时间久，是棉花生 产中最具毁灭性的病害之一。在我国，生产上一直没有找到理想的防治技术与控制方法， 因此被称之为棉花的“癌症”(陈捷胤等，2005)。选育和推广抗黄萎病品种，是我国也是 世界各产棉国防治黄萎病最经济有效，而且是唯一有效的途径(顾本康等，1996)。

我国育种专家经过几十年的努力，利用常规育种手段，获得了一些对黄萎病具有一定 抗病能力的地方品种。但是，黄萎病菌变异快、小种多，具有明显的致病力分化，针对黄 萎病菌这种特性的广谱抗性棉花品种基本没有，因此，在一个地区表现为抗病的棉种到另 一个不同生理和地理条件下抗病性就会丧失。另一方面，由于陆地棉栽培种内缺乏高抗黄 萎病的抗源，直接导致了我国棉花抗黄萎病育种进程缓慢，特别是抗落叶型黄萎病育种基 本没有进展(马存等，2002)。此外，不同地域种子交流导致病原菌在地方上的种类越来 越多，形成了复合种群。各地的棉花黄萎病菌均存在致病力的分化和提高，强致病力菌系 的出现是造成棉花黄萎病逐年加重的主要原因之一(房卫平等，2001)。为此，解决生产 中抗黄萎病资源缺乏的问题已迫在眉睫，急需获得具有广谱和持久抗性的抗源以减轻棉花 生产中因黄萎病造成的巨大损失。利用几丁酶基因提高棉花对黄萎病的抗性，我国的乐锦 华(2002)和程红梅(2005)等已取得了一些进展。但他们所用的几丁酶基因都来自植物。 由于进化的原因，来自植物的基因转入植物后，病原菌对转基因表达产物容易产生耐性。 因此，利用几丁酶基因提高棉花对黄萎病的抗性还有待进一步的进行研究和寻找新的基 因，特别是寻找和研究非植物来源的几丁酶基因。

发明内容

本发明的目的是提供一种成本低、效果好的利用球孢白僵菌几丁酶基因提高植物抗病 性的方法。

本发明的目的是这样实现的：一种利用球孢白僵菌几丁酶基因提高植物抗病性的方 法，其特征在于，包括如下步骤：