[发明专利]同时检测乙型肝炎病毒三种核苷酸类似物耐药位点的方法及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及检测乙型肝炎病毒耐药的方法，特别涉及采用反向斑点杂交技术检测 乙型肝炎病毒对三类核苷酸类似物耐药的方法，还涉及用于临床检验的试剂盒。

背景技术

乙型肝炎病毒的感染呈世界范围广泛流行，尤其我国感染者占到全球的1/3。慢性 感染者中的5％～10％可导致肝癌(HCC)，30％进展为肝硬化，而肝硬化患者中的23％ 会在5年内发生肝功能衰竭。据统计，我国每年用于HBV感染患者的医疗和保健费用 高达1000亿人民币。因此，HBV感染严重危害人民健康，造成国民经济严重损失。

抗乙肝病毒药物治疗已被国际上公认为有效治疗的关键。目前，主要有干扰素类 和核苷类似物(NRTI)两大类。干扰素类主要通过免疫调节和抗病毒而发挥作用，疗 效相对持久，耐药少，不良反应较明显，尤其不适合肝功能失代偿患者。而核苷酸类似 物(NRTI)，通过抑制逆转录酶活性并终止链延伸来达到抑制病毒复制的作用。目前， 抗HBV的核苷类似物药物主要有以下3类：左旋核苷酸类似物，无环核苷磷酸盐，脱 氧鸟苷类似物，代表药物分别为：拉米夫定(lamivudine)阿德福韦双酯(adefovir dipivoxil)恩替卡韦(enticavir)。核苷酸类似物的作用较强，且不良反应少，被广泛用于 临床治疗，但长期使用极易引发耐药突变。

HBV为嗜肝DNA病毒，复制速度快，且其复制所必需的DNA聚合酶缺乏严格的 矫正机制，使得HBV基因组自身变异率较高，同时，随着治疗时间的延长，在机体和 药物的选择压力下，也会出现不同程度的耐药突变。临床实验表明，任何单一药物产生 的耐药会在一定程度上表现出对该族其他药物的交叉耐药性，从而可能降低其他族 NRTI治疗敏感性。那么，耐药变异株的出现就会引起HBV DNA复制反跳、谷丙转氨 酶ALT活性升高，严重影响预后，甚至可能造成新型突变株的传播，给全球性的公共 卫生带来隐患。因此，有效和动态的监测HBV对不同药物的耐药情况，可以减少耐药 突变株的形成和药物间的交叉耐药，同时对HBV感染者个体化治疗方案的选择有重大 临床意义。

乙型肝炎病毒是不完整的双链DNA，在DNA聚合酶的作用下，逆转录合成HBV DNA 的负链，再互补合成相对应的正链DNA，完成HBV基因组复制。而拉米夫定，阿德福韦 酯和恩替卡韦等核苷酸类似物均作用于该逆转录这一过程。其中DNA聚合酶的逆转录 酶活性区域RT为药物作用靶点区域，且相关耐药突变也主要发生在此区域。目前，用 于耐药突变检测的方法主要包括直接测序、限制性片段长度多态性分析(RFLP)、单链 构象多态性分析(single-strand conformational polymorphisms，SSCP)、实时荧光 PCR，以及基于反向杂交原理的基因芯片技术和线性探针分析法等。

(1)PCR产物直接测序法：能够检测到整个序列中的几乎所有可能的突变，但容易 忽略小于准种的20％的低丰度耐药株序列，且测序结果易受到非特异条带等的影响， 从而产生高背景，使得结果判读不准确。克隆技术虽然能弥补上述不足，但需要分析大 量的克隆株，相对耗费人力物力。

(2)限制性片段长度多态性分析(RFLP)：首先对每个已知的耐药位点设计野生 型和耐药型的特异性核酸内切酶识别位点，经PCR和酶切后，根据酶切图谱来反应是否 发生耐药突变。虽然其检测灵敏度较高，但是由于每个检测位点均需要建立一个独立的 酶切反应体系，操作繁琐，况且并不是每个耐药位点都可以找到相应的酶切位点，技术 难度大。

(3)单链构象多态性分析(SSCP)：在监测病毒耐药毒株的出现和动态变化时， 能检测出单个碱基的突变，但扩增的PCR产物不能太长，最好在150bp左右，而且，如 果点突变发生在扩增片段两端时，由于点突变引起的空间构象甚微，导致电泳迁移率相 差无几，易出现假阴性结果。

(4)实时荧光PCR：通过融解温度的不同检测HBV不同的耐药位点突变株，但对于 多位点或相邻位点的分析比较困难。

(5)基因芯片技术：可以高通量、多位点检测HBV的耐药突变，但对扩增产物的 检测需要特殊仪器和训练有素的技术人员及多步洗涤、孵育步骤，过程复杂费时。