[发明专利]多色量子点组合微球编码的液体芯片及其制备方法和检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种液体芯片，特别涉及一种多色量子点组合微球编码的液 体芯片，还涉及该液体芯片的制备方法和检测方法。

背景技术

微生物的种类很多，其中传染性最强、危害性最重的是细菌、衣原体和 立克次体类病原微生物。病原微生物的传统检测是以病原微生物表型特征为 基础，主要采用分离培养结合形态特性、生化鉴定和免疫分析等方法，存在 操作复杂耗时、条件要求苛刻、阳性率低等缺点，且许多细菌的生化特征和 抗生素敏感型等表型特征不稳定，易受到基因调控、质粒获失及技术操作等 方面的影响。近年来，以分子生物学为基础的鉴定方法如质粒分析、核酸杂 交、限制性片段多态性分析和聚合酶链式反应(PCR)等，克服了上述病原 微生物传统检测方法存在的缺点和客观因素对其产生的影响，大大提高了检 测的特异性和准确度，其中生物芯片技术凭借其高通量优势在病原微生物的 快速侦检中发挥了重要作用。但常规生物芯片为固体芯片，由于空间位阻的 影响，核酸杂交效率较低。为克服此缺点，液体芯片应运而生。

液体芯片，又称悬浮阵列，该技术的核心是将聚苯乙烯微球用荧光染色 的方法进行编码，然后将每种颜色的微球(或称为荧光编码微球)共价交联 上针对特定核酸的探针。应用时，将检测样本与多种连有特定核酸探针的微 球同时进行杂交反应，反应完成后，仪器通过两束激光分别识别编码微球和 检测微球上报告分子的荧光强度，从而对靶核酸进行定量检测。由于整个反 应在液相中完成，反应速度快，杂交效率高，并可以在一个微量反应体系中 同时检测多达上百条靶序列，尤其适合病原微生物的快速侦检。然而，近年 研究结果显示，液体芯片技术尚存在灵敏度较低、重复性较差等不足，其原 因主要是不同荧光标记物的发射光谱在液相中广泛重叠，导致大量假阳性结 果产生，限制了液体芯片技术在病原微生物侦检中的进一步推广应用。因此， 寻找一种能以不同颜色分别标记探针，且发光强度高，不易淬灭，光谱之间 重叠少的荧光标记物是提高液体芯片检测灵敏度和重复性的关键。

量子点(quantum dots，QDs)的出现为克服以上问题带来了希望。量子 点是一种由周期表中II-VI族或III-V族元素组成，直径在1～10nm之间，能够 接受激发光产生荧光的半导体纳米颗粒。与传统的有机荧光染料相比，量子 点具有许多独特的理化特性：①发射波长可调谐，可通过控制量子点的粒径 大小来调节其发射荧光的颜色；②激发波长范围宽，从紫外区到近红外区， 可以用同一波长的光激发不同发射波长的量子点；③发射峰狭窄且对称，半 高峰宽通常为25～45nm；④荧光强度高且稳定，对光漂白有强烈的抵制作用。 量子点的优越荧光性能使其作为新型荧光标记物，在肿瘤活体成像与靶向治 疗、分子诊断等领域中已显示出巨大潜力。但是直接用不同粒径的量子点制 备多色荧光标记探针时尚存在如下问题，即不同粒径量子点-探针复合物的最 佳杂交条件是不一致的，因而难以同时实现多色荧光标记探针的检测条件优 化，这对条件要求较高的核酸杂交实验结果的影响尤为明显。为克服以上问 题，有研究者采用将多个量子点组装于同一粒径的微球内的方式来实现标记 物质的均一化，通过控制量子点装配的种类和数量实现了超过1000种颜色的 DNA标记，为多色量子点的生物标记奠定了基础。

发明内容

有鉴于此，为克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种多色 量子点组合微球编码的液体芯片，目的之二在于提供所述液体芯片的制备方法， 目的之三在于提供所述液体芯片的检测方法，从而为病原微生物的快速侦检及 其它核酸检测项目提供一种操作简单、高通量、灵敏度高、重复性好的新方 案。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

1、多色量子点组合微球编码的液体芯片，由通用引物和至少两种核酸检测 系统组成，每种核酸检测系统由多色量子点组合微球标记的探针P1和磁性微球 标记的探针P2组成；所述探针P1和P2分别与靶核酸序列两端互补，P1和P2 之间不互补；所述多色量子点组合微球由球体和装载在球体中的多色量子点组 合物组成；所述多色量子点组合物是从n种具有不同荧光发射波长的量子点中 任取m种组合而成，n和m均为正整数且m≤n；不同核酸检测系统分别用球体 粒径相同但荧光发射波长不同的多色量子点组合微球标记探针P1。