[发明专利]一种乳酸菌食品级表达载体pMG36N及其制备方法

权利要求书

1.一种乳酸菌食品级表达载体pMG36N，其特征在于该表达载体是通过改造乳酸菌表达载体pMG36e得到的，所述改造是将乳酸菌表达载体pMG36e中的红霉素抗性基因敲除，引入乳链菌肽Nisin抗性基因nisI片段。

2.如权利要求1所述的乳酸菌食品级表达载体pMG36N，其特征在于所述编码脂蛋白NisI的nisI碱基序列来源于产Nisin的乳酸菌。

3.权利要求1所述乳酸菌食品级表达载体pMG36N的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)设计引物p1和p2，以pLEB590为模板，扩增出编码脂蛋白NisI的nisI片段，其中，p1序列如SEQ ID NO：1所示，p2序列如SEQ ID NO：2所示；

(2)将nisI片段纯化后，进行双酶切；

(3)经双酶切后的nisI片段与经相同酶切处理的pMG36e在DNA连接酶的作用下进行连接，连接液热激转化至大肠杆菌感受态；

(4)取转化菌液涂布在含红霉素的平板上，37℃培养后，挑单克隆至含红霉素的液体培养基中培养，提取质粒进行酶切鉴定、测序，将阳性重组子命名为pMG36e-NisI；

(5)将pMG36e-NisI转化至MG1363中，然后将转化菌液涂布在含Nisin的平板上，30℃培养，挑单克隆至含Nisin的液体培养基中培养，提取质粒进行酶切鉴定；

(6)设计引物p3和p4，扩增出pMG36e-NisI中除红霉素基因以外的片段，此片段即为pMG36N，其中，p3序列如SEQ ID NO：3所示，p4序列如SEQ ID NO：4所示。

4.如权利要求3所述乳酸菌食品级表达载体pMG36N的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)设计引物p1和p2，以pLEB590为模板，扩增出编码脂蛋白NisI的nisI片段，其中，p1序列如SEQ ID NO：1所示，p2序列如SEQ ID NO：2所示；

(2)将nisI片段进行纯化后，用XbaI+PstI进行双酶切；

(3)经双酶切后的nisI片段与经相同酶切处理的pMG36e在T4DNA连接酶的作用下进行连接，连接液热激转化至E.coli XL-Blue的感受态；

(4)取转化菌液40ul涂布在含红霉素的LB平板上，37℃培养16小时后，挑单克隆至含红霉素的液体LB中过夜培养，提取质粒进行酶切鉴定、测序，将阳性重组子命名为pMG36e-NisI；

(5)将pMG36e-NisI电转化至MG1363中，然后将电转化菌液涂布在含Nisin的GM17平板上，30℃培养3天，挑单克隆至含Nisin的液体GM17中30℃静置过夜培养，提取质粒进行酶切鉴定；

(6)设计引物p3和p4扩增出pMG36e-NisI中除红霉素基因以外的片段，此片段即为pMG36N，其中，p3序列如SEQ ID NO：3所示，p4序列如SEQ ID NO：4所示；

(7)将pMG36N的PCR产物进行纯化后，用EcoRI进行酶切处理；

(8)将上述酶切产物进行纯化，然后等体积加入T载体试剂盒中的Solution I，16℃让其自连过夜；

(9)将连接液电转化至MG1363中，然后将电转化菌液涂布在含Nisin的GM17平板上，30℃培养3天左右，挑单克隆至含Nisin的液体GM17中，30℃静置过夜培养，提取质粒进行鉴定，并将菌液转接至含红霉素的液体GM17中进行复检。

5.如权利要求3或4所述乳酸菌食品级表达载体pMG36N的制备方法，其特征在于所述步骤(1)中，p1引入XbaI位点，p2引入PstI位点。

6.如权利要求3或4所述乳酸菌食品级表达载体pMG36N的制备方法，其特征在于所述步骤(6)中，p3和p4的上游和下游均引入EcoRI位点。