[发明专利]一种乳酸菌食品级表达载体pMG36N及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种乳酸菌食品级表达载体pMG36N及其制备方法。

背景技术

乳酸菌(LAB)是一类被公认安全的食品级微生物(generally regard as safe，GRAS)，它包括乳酸乳球菌、双歧杆菌及乳酸杆菌等十几个属，是人类一大益生菌，有增加食物的营养价值、改善肠道环境、改善乳糖代谢、控制血清胆固醇水平、抑制致病菌繁殖、抗肿瘤活性等功能，在食品发酵、医药等与人类生活密切相关的领域有着极其重要的作用。

乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)作为乳酸菌的一个模式种长期应用于食品发酵工业，用于生产和保存乳制品及作为异源蛋白的输送载体，已逐渐成为在食品工业、微生物药物和疫苗研究等领域具有极其重要应用前景的基因工程菌。近年来，构建乳酸菌食品级表达系统，探究一些有实际应用价值的基因在乳酸菌中的克隆和表达已成为乳酸菌分子遗传学的研究热点。

传统的乳酸菌表达载体大多以红霉素或氯霉素等抗生素抗性基因作为筛选标记，但将抗生素抗性基因投放到环境中或人和动物体内，由于存在抗性因子转移的隐患，可能带来生物安全性的严重后果，所以从食品安全性考虑，含抗生素抗性基因标记的微生物不能应用于食品生产中。目前国内外报道的食品级选择标记有α-半乳糖苷酶基因aga，镉抗性基因Cd^R，丙氨酸消旋酶基因ala等，由于上述选择标记是非乳酸菌来源的，其应用安全性将受到一定的限制。

Nisin抗性基因nisI所编码的蛋白NisI，是乳链菌肽Nisin产生菌为防御Nisin对自身的毒害作用而产生的一种脂蛋白，将其导入对Nisin敏感的宿主菌中，能赋予宿主菌对Nisin的抗性，这为它的应用带来了极大的方便。此外，Nisin是被公认安全无毒的天然食品防腐剂，且nisI基因来源于产Nisin的乳酸菌，这使得将nisI基因作为乳酸菌食品级选择标记更有优势。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种可以用于食品生产的安全的乳酸菌食品级表达载体pMG36N。

本发明的另一目的在于提供上述表达载体pMG36N的制备方法。

本发明通过如下技术方案予以实现：

在乳酸菌表达载体pMG36e的基础上，敲除了编码红霉素抗性基因的碱基序列，插入了编码脂蛋白NisI的nisI碱基序列，还保留了pMG36e中的p32启动子、pUC18的多克隆位点及pWV01的复制子片段。

其中，所述编码脂蛋白NisI的nisI碱基序列来源于产Nisin的乳酸菌。

所述pMG36e中p32启动子、pUC18的多克隆位点及pWV01的复制子片段均来源于乳酸菌。

本发明乳酸菌食品级表达载体pMG36N的制备方法包括如下步骤：

(1)设计引物p1和p2，以pLEB590为模板，扩增出编码脂蛋白NisI的nisI片段，其中，p1序列如SEQ ID NO：1所示，p2序列如SEQ ID NO：2所示；

(2)将nisI片段进行纯化后，进行双酶切；

(3)经双酶切后的nisI片段与经相同酶切处理的pMG36e在DNA连接酶的作用下进行连接，连接液热激转化至感受态；

(4)取转化菌液涂布在含红霉素的平板上，37℃培养后，挑单克隆至含红霉素的培养基中培养，提取质粒进行酶切鉴定、测序，将阳性重组子命名为pMG36e-NisI；

(5)将pMG36e-NisI转化至MG1363中，然后将转化菌液涂布在含Nisin的平板上，30℃培养，挑单克隆至含Nisin的培养基中培养，提取质粒进行酶切鉴定；

(6)设计引物p3和p4，扩增出pMG36e-NisI中除红霉素基因以外的片段，此片段即为pMG36N，其中，p3序列如SEQ ID NO：3所示，p4序列如SEQ ID NO：4所示。

上述制备方法优选为：

(1)设计引物p1和p2，以pLEB590为模板，扩增出编码脂蛋白NisI的nisI片段，其中，p1序列如SEQ ID NO：1所示，p2序列如SEQ ID NO：2所示；；

(2)将nisI片段进行纯化后，用XbaI+PstI进行双酶切；

(3)经双酶切后的nisI片段与经相同酶切处理的pMG36e在T4DNA连接酶的作用下进行连接，连接液热激转化至E.coli XL-Blue感受态；