[发明专利]一种海洋放线菌及其代谢物的制备方法与应用

权利要求书

1.一种海洋放线菌，其特征在于：所述海洋放线菌命名为阳江链霉菌(Streptomyces yangjiangensis)，于2009年7月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M209167。

2.权利要求1所述海洋放线菌的代谢物的制备方法，其特征在于：包含以下步骤：

(1)阳江链霉菌的培养

使用改良的高氏一号培养基制备斜面培养基，于28～30℃在斜面培养基上培养阳江链霉菌，直至菌丝和孢子生长成熟；

所述的改良的高氏一号培养基，其具体组成如下：可溶性淀粉20g，KNO₃1g，海水精3g，K₂HPO₄·3H₂O 0.66g，FeSO₄·7H₂O 0.02g，MgSO₄·7H₂O 1.03g，琼脂16g，pH值为7.2～7.4，水定容至1000ml，于115～121℃灭菌30min；

(2)阳江链霉菌的发酵

A、阳江链霉菌种子液的制备：将斜面上的菌丝和孢子接入发酵培养基，28～30℃下160～180rpm培养48～60h得到阳江链霉菌种子液；

B、阳江链霉菌的发酵：将阳江链霉菌种子液以体积百分比8～10％的接种量接至发酵培养基中，于28～30℃以300～400rpm的转速、10～15L/min的空气通气量进行发酵90～96小时；

所述的发酵培养基组成为：酵母粉30g，玉米淀粉20g，海水精3g，CaCO₃2g，KNO₃ 2g，K₂HPO₄·3H₂O 0.66g，FeSO₄·7H₂O 0.02g，MgSO₄·7H₂O 1.03g，pH值为7.2～7.4，水定容至1000ml，于115～121℃灭菌30min；

(3)对青枯病有显著抑制作用的阳江链霉菌的代谢物的制备

A、将发酵液离心，得到上清液和菌丝体；

B、上清液用乙酸乙酯萃取至少2次，取萃取液，减压浓缩至没有乙酸乙酯，得到粗提物I；

C、菌丝体用体积百分比为80～90％乙醇溶液浸提6小时以上，体积百分比为80～90％乙醇溶液的加入量为菌丝体质量的2～4倍，浸提至少2次，将浸提液合并，减压浓缩至没有乙醇，得到浸提液的水层；接着用乙酸乙酯萃取浸提液的水层至少2次，取萃取液，减压浓缩至没有乙酸乙酯，得到粗提物II；

D、粗提物I和粗提物II合并，得到粗提物，接着通过硅胶柱层析进行分离，洗脱液为石油醚和丙酮的混合液，极性由小至大洗脱，石油醚和丙酮的洗 脱起始体积比为5∶1，结束体积比为1∶5；每10g粗提物使用40～50g硅胶进行层析，洗脱时间设置为1180分钟，流速为5mL/min，每100mL为一收集单位，取第17～25收集单位；

E、接着，将第17～25收集单位合并，得S_A组分，通过硅胶柱层析分离，洗脱液为石油醚和丙酮按体积比为1∶1.7混合；每1.25g S_A组分使用5～6g硅胶进行层析，流速为2mL/min，每50mL为一收集单位，第二收集单位即为对花生青枯病菌有显著抑制作用的阳江链霉菌的代谢物；

所述的硅胶柱的规格为200～300目。

3.根据权利要求2所述海洋放线菌的代谢物的制备方法，其特征在于：步骤(3)A中，所述的离心的条件为4800rpm离心10分钟。

4.根据权利要求2所述海洋放线菌的代谢物的制备方法，其特征在于：步骤(3)B中所述的萃取为乙酸乙酯与上清液按体积比1∶1混合后进行萃取。

5.根据权利要求2所述海洋放线菌的代谢物的制备方法，其特征在于：步骤(3)C中所述的浸提于30℃～50℃下进行。

6.根据权利要求2所述海洋放线菌的代谢物的制备方法，其特征在于：步骤(3)C中所述的萃取为乙酸乙酯与浸提液按体积比1∶1混合后进行萃取。

7.一种阳江链霉菌的代谢物，通过权利要求2～6任一项所述的制备方法进行制备。