[发明专利]一种海洋放线菌及其代谢物的制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于生物农药研究领域，特别涉及一种海洋放线菌及其代谢物的制备方法与应用。

背景技术

花生是我国重要的经济作物和油料作物，青枯病(Pseudomonassolanacearum)是花生上的毁灭性病害。我国花生青枯病发病面积约300khm²，华南地区是青枯病的重点发病区，发病率通常在10～20％，尤以苗期最为严重，发病严重的损失达70％以上。目前还没有有效的农药可用，防治该病最经济有效的途径是培育和种植抗青枯病的花生品种并采用生物防治等新方法，因此寻找防治青枯病新活性生物代谢产物是重要的防治途径之一。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种海洋放线菌，其代谢物具有显著的抑制青枯病菌的作用。

本发明的另一目的在于提供上述海洋放线菌的代谢物的制备方法。

本发明的再一目的在于提供所述代谢物的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种海洋放线菌，名称为阳江链霉菌(Streptomyces yangjiangensis)，于2009年7月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M209167；

所述阳江链霉菌在高氏一号培养基上生长良好、气丝II 61′灰色，基丝鲛青，孢子丝颜色灰色，产淡黄色素；在光学显微镜下观察，基丝不断裂、气生菌丝形成孢子丝，孢子丝直、柔曲。在扫描电镜下观察，孢子为短圆柱形，轴长约0.6～0.7μm，径长约0.9～1.0μm；孢子表面光滑、不带刺、无疣、链生；

所述阳江链霉菌的16S rDNA序列如SEQ ID：No.1所示。

所述阳江链霉菌的代谢物的制备方法，包含以下步骤：

(1)阳江链霉菌的培养

使用斜面培养基于28～30℃培养阳江链霉菌，直至菌丝和孢子生长成熟；

所述培养基为改良的高氏一号培养基，其具体组成如下：可溶性淀粉20g，KNO₃1g，海水精3g，K₂HPO₄·3H₂O 0.66g，FeSO₄·7H₂O 0.02g，MgSO₄·7H₂O1.03g，琼脂16g，pH值为7.2～7.4，水定容至1000ml，于115～121℃灭菌30min；

(2)阳江链霉菌的发酵

A、阳江链霉菌种子液的制备：将斜面上的菌丝和孢子接入发酵培养基，28～30℃下160～180rpm培养48～60h得到阳江链霉菌种子液；

B、阳江链霉菌的发酵：将阳江链霉菌种子液以体积百分比8～10％的接种量接至发酵培养基中，于28～30℃以300～400rpm的转速、10～15L/min的空气通气量进行发酵90～96小时；

所述的发酵培养基组成为：酵母粉30g，玉米淀粉20g，海水精3g，CaCO₃2g，KNO₃2g，K₂HPO₄·3H₂O 0.66g，FeSO₄·7H₂O 0.02g，MgSO₄·7H₂O 1.03g，pH值为7.2～7.4，水定容至1000ml，于115～121℃灭菌30min；

(3)对青枯病有显著抑制作用的阳江链霉菌的代谢物的制备

A、将发酵液离心，得到上清液和菌丝体；

B、上清液用乙酸乙酯萃取至少2次，取萃取液，减压浓缩至没有乙酸乙酯，得到粗提物I；

C、菌丝体用80～90％乙醇溶液浸提6小时以上，80～90％乙醇溶液的加入量为菌丝体质量的2～4倍，浸提至少2次，将浸提液合并，减压浓缩至没有乙醇，得到浸提液的水层；接着用乙酸乙酯萃取浸提液的水层至少2次，取萃取液，减压浓缩至没有乙酸乙酯，得到粗提物II；

D、粗提物I和粗提物II合并，得到粗提物，接着通过硅胶柱(200～300目)层析进行分离，洗脱液为石油醚和丙酮的混合液，极性由小至大洗脱，石油醚和丙酮的洗脱起始体积比为5∶1，结束体积比为1∶5；每10g粗提物使用40～50g硅胶进行层析，洗脱时间设置为1180分钟，流速为5mL/min，每100mL为一收集单位，取第17～25收集单位；