[发明专利]TPMT基因SNP检测的特异性序列、液相芯片及方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及TPMT基因SNP检测的 特异性序列、液相芯片及方法。

背景技术

硫嘌呤类药物在临床上常用于白血病、实体肿瘤的抗癌治疗和器官移植后的免疫抑制治 疗，已有将近40年的历史，包括6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine，6-MP)、硫唑嘌呤 (azathioprine，AZA)和6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine，6-TG)。如6-MP是急性淋巴细胞白血 病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)维持疗法的主要药物之一，而AZA则是近年来治 疗类风湿性关节炎和Crohn病最常用的药物之一。然而，这类药物可产生严重的甚至可危及生 命的血液毒性，导致治疗被迫中断，造成治疗失败，因此其合理使用在临床上备受关注。

TPMT在硫嘌呤类药物的体内代谢中起着重要作用，其遗传差异是影响硫嘌呤类药物代谢 及药理效应的主要因素。TPMT的作用是将硫嘌呤类药物的活性代谢物6-TGN转变成无活性的 6-MMP。如果患者遗传有TPMT缺陷，则在使用常规剂量的硫嘌呤类药物时，导致无活性的6- 甲巯基嘌呤减少，而有活性的6-TGN增多并积累，很可能发生致命的毒性反应，如严重的骨髓 抑制和肝损害等。与此相反，TPMT活性愈高，形成6-TGN的6-MP就愈少，一些服用标准剂量6-MP 但6-TGN浓度很低的儿童面临疾病复发的危险性通常较高。

对不同人种的研究发现，导致TPMT编码酶蛋白活性降低的突变等位基因主要有4种： TPMT*2(G238C)、TPMT*3A(G460A/A719G)、TPMT*3B(G460A)和TPMT*3C(A719G)，这四类等位 基因可以解释约95％的TPMT酶活性降低。其中，中国人群的TPMT*3C等位基因频率约为2.3％。

早在2003年，美国FDA就建议在6-巯基嘌呤药物使用前进行TPMT检测。对TPMT基因型的检 测结果将有助于预测硫嘌呤类药物的毒性，同时可据此调整给药方案，做到用药的个体化， 避免因剂量不足造成的维持治疗期间复发，更能避免因剂量过大而产生的严重的不良反应。 对于缺乏TPMT酶活性的患者，则可考虑其他的治疗方案。

目前国内外已有检测TPMT基因多态性的产品上市，如Prometheus laboratories，Lab21， Specialty laboratories，Quest Diagnosis、主动健康-基因检测公司和华大基因研发中心 等。目前的产品主要建立在传统固相芯片的基础上，价格昂贵，而且敏感性不高，检测结果 的可重复性差。而其它以PCR为基础的检测SNPs的技术，如直接测序法，半定量PCR技术，PCR -单链构象多态性分析(SSCP)检测，这些技术存在灵敏度低，样品易污染、假阳性率高的缺 点，普通PCR方法和荧光定量PCR由于检测通量的局限性不能满足临床的需要。而聚合酶链式 反应-限制性片段长度多态(PCR-RFLP)分析技术和基于TaqMan技术的等位基因差异分析法 一次只能进行一种突变的检测，耗时费力。

基于芯片的原理，美国Luminex公司开发出了以微球为载体的悬浮液相芯片技术。该项技 术利用聚苯乙烯微球作为反应的载体，以荧光检测仪作为检测平台，对核酸和蛋白质等生物 大分子进行高通量的多指标并行检测。在微球的制造过程中，掺入不同比例的红光及红外光 染色剂，从而形成多至100种不同颜色编码的微球。不同的微球共价结合了针对不同待检测物 的蛋白质或核酸分子作为探针分子，报告分子以生物素标记，并用高灵敏的荧光染料染色。 这些微球与待测物、报告分子、荧光标记物就形成完整的微球检测体系用于Luminex系统的读 取。Luminex阅读系统分别激发红色激光和绿色激光用于微球体系的检测，其中红色激光检测 微球表面红色分类荧光的强度，并根据微球中不同色彩而编号分类，从而确定反应的类型； 绿色激光检测样本中荧光标记物的荧光强度，再通过机器与计算机自动统计分析激光所检测 到微球种类、数量，从而判定待测样本多种目标测试物各自的浓度。因此，液相芯片技术既 满足了高通量检测的要求，同时具备了快速准确，灵敏度高，特异性好，结果重复性好等优 点。我们采用xTAG液相芯片技术可以同时检测多种SNPs，实现高通量快速简便化操作，大大 提高了检测效率，在同类检测技术中处于领先地位。

发明内容