[发明专利]一种新橙皮苷的高通量酶法合成方法

说明书

技术领域

本发明涉及食品添加剂领域，特别涉及低热值甜味剂新橙皮苷二氢查耳酮 (NHDC)的酶法合成，具体是提供了一种新橙皮苷(NH)的高通量酶法合成 方法。

技术背景

NHDC是一种安全的低热值甜味剂(蔗糖甜度的1500～1800倍)和苦味抑 制剂，热稳定性好，应用pH范围广，在食品和医药领域广为使用，常以新橙皮 苷为前体通过酶法或化学法合成(中国发明专利ZL02806186、ZL200510055397 和ZL200410042658)。在其合成中，底物NH来源受限是主要的技术瓶颈。NH 既可从枳实和枳壳中提取(中国发明专利ZL200710111229、ZL200810036498、 ZL200410025729、ZL200710017735和ZL200310112480)，也可通过柚皮苷转化 而来(中国发明专利03124495)，但是这两种原料在中国都极为有限。另一方面， 在2007年中国柑橘种植面积(191万公顷)和产量(2095吨)分别跃居世界第 一，柑橘加工产业中富含大量橙皮苷的橙皮废弃物(约占果重的1/3，90％橙皮 所含黄烷酮中都是橙皮苷占优势，约占果皮重的7％，见中国发明专利 ZL200710034378)和工业废水需要处理(含橙皮苷约1％)。因此，以来源广泛 的橙皮苷向其同分异构体新橙皮苷的高效转化，是值得关注的课题：既可解决 市场前景广阔的甜味剂NHDC合成前体NH来源问题，又可解决中国柑橘废弃 橙皮和加工废水的处理和资源利用问题。

研究报道的橙皮苷向NH的转化方法主要有：一种是酶法，以橙皮苷酶酶解 橙皮苷为葡萄糖基橙皮素糖苷(HG)，再以为葡萄糖基转移酶作用HG得橙皮素， 再把橙皮素接技新橙皮糖后即可，相应中国发明专利：ZL200610052962、 ZL200610051963；另一种是水解，即以高温酸水解橙皮苷为GH，再把GH分离 后按酶法合成新橙皮苷，相应中国专利包括：ZL200810099008。上述技术存在 如下问题：

(1)底物橙皮苷水溶性差，即使在80℃高温下也只是微溶(小于1g/L)， 影响橙皮苷酶酶解效率。虽然国内已有关于水溶性橙皮苷制备的专利方法(如 添加磺酸基、金属离子配位或是甲基化等)，但都是以提高橙皮的生物活性或是 拓展橙皮苷的应用范围为目的，而不是以改进新橙皮苷的制备方法为目的，而 且水溶性橙皮苷的分子结构和化学基团都已发生变化，成为另一种物质，不一 定适合于新橙皮的酶法或化学法制备。

(2)在高温下对橙皮苷进行水解，水解副产物多，包括橙皮素、芸香糖、 鼠李糖、葡萄糖、葡萄糖基橙皮素等，使得目的产物GH的分离纯化困难，还 产生大量工业废水需要处理。

(3)由于酶解反应效率低，或是橙皮苷化学法水解的分离纯化过程复杂， 上述二种方法都难以工业化。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的缺陷，通过配位改性制备水溶性橙皮苷 金属配合物，再以此为底物，利用反应条件温和、副反应少、易于工业化的固 定化橙皮苷酶和鼠李糖基转移酶，高通量酶法制备目的产物NH，解决长期以来 甜味剂NHDC合成前体(NH)来源受限的技术瓶颈问题，提出一种解决中国柑 橘工业废弃橙皮的环境污染和高值化资源利用问题的新方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种新橙皮苷的高通量酶法合成方法，包括下述步骤：

(1)橙皮苷与金属离子溶液通过配合反应制备橙皮苷金属配合物水溶液；

(2)加固定化橙皮苷酶到步骤(1)所得橙皮苷金属配合物水溶液中，发生 酶解反应，得橙皮苷酶解产物；

(3)加固定化鼠李糖基转移酶1，2-RhaT到步骤(2)所得橙皮苷酶解产物 中，发生酶解反应，得到新橙皮苷盐；

(4)去除步骤(2)所得新橙皮苷盐中的金属离子，得新橙皮苷。

作为优选，所述橙皮苷金属配合物常温下的溶解度在1.85g/L以上。

作为优选，步骤(1)中，所述配合反应的介质要求是50％～80％甲醇，配 合反应温度为40℃～85℃。

作为优选，步骤(2)中，所述酶解反应的温度为45℃～65℃，反应体系pH 值为2～4，反应时间为20min～60min。

作为优选，步骤(3)中，所述酶解反应的反应温度为25℃～35℃，反应时 间为24h～48h。