[发明专利]人增殖诱导配体阻断剂及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及一种人B淋巴细胞刺激因子和增殖诱导配体阻断剂BCMA-Fc及其制备方法和应用。

背景技术

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)和干燥综合征(Sjogren syndrome，SS)是严重的自身免疫性疾病，严重危害人类健康和生命。至今，这类疾病尚无特效治疗药物；临床治疗中，一般采用糖皮质激素和免疫抑制剂对症治疗，但，治疗实践表明疗效差，副作用大。

研究表明，该类疾病的发病机理主要是由于B淋巴细胞刺激因子(BLyS)与增殖诱导配体过度表达(增殖诱导配体)，通过与其受体结合，使自反应性B细胞发生凋亡逃避，自反应性B细胞增殖，产生大量的自身抗体，发生组织损害，抗原抗体复合物的积聚会导致狼疮性肾炎并发症。此外B淋巴细胞刺激因子(BLyS)与增殖诱导配体过度表达，刺激B淋巴细胞过度增殖、分化，参与免疫应答。因此，有关研究人员推测，阻断BLys与其受体结合可能形成治疗SLE、RA和SS的特效创新性药物。

随着计算机科学的迅猛发展，近年来计算机辅助药物设计成为研究与开发新药的崭新技术，它大大加快了新药设计的速度和效率。蛋白质结构的不断解析，PDB数据不断增长，为计算机辅助设计蛋白质药物成为可能。基于蛋白质空间结构的蛋白质药物研究倍受重视。

毕赤酵母表达系统，具备真核表达系统和原核表达系统的优点，蛋白质可以正确折叠，AOX强效启动子，外源基因基因产物表达量高。酵母培养，转化，高密度发酵等操作简单。另外，毕赤酵母可以分泌性表达，便于产物纯化。甲醇作为诱导物，生产成本低，适于工业化生产。目前毕赤酵母表达系统已经广泛应用于蛋白质药物的表达。

发明内容

本发明的目的是提供一种人增殖诱导配体阻断剂，尤其涉及人B淋巴细胞刺激因子和增殖诱导配体阻断剂BCMA-Fc设计及其制备方法。

本发明基于蛋白质分子空间构象，根据BCMA和增殖诱导配体的作用结构域，通过计算机蛋白质分子模拟技术，以增殖诱导配体为靶蛋白，以BCMA为目标结构，经过优化得到与增殖诱导配体具有高亲和力的BCMA-Fc融合蛋白；毕赤酵母表达上述融合蛋白，所得融合蛋白具有增殖诱导配体结合能力，并能有效抑制增殖诱导配体诱导的RajiB淋巴细胞瘤增殖。本发明的人增殖诱导配体阻断剂同时具备免疫原性低，制备过程简便、安全，产品得率、纯度、活性高等特性。

具体而言，本发明通过计算机模拟构建BCMA-FC蛋白质三维结构模型，通过分子对接预测BCMA-Fc具备增殖诱导配体结合能力。构建pPIC9K酵母表达载体，电转化毕赤酵母后，通过营养缺陷和G418抗性两步筛选，获得高表达转化子，使用毕赤酵母表达BCMA-Fc融合蛋白，经过超滤浓缩，分子筛和rProteinA亲和层析，得到BCMA-Fc融合蛋白，具有序列1的结构，产率为10mg/L，经活性检测证实BCMA-Fc具备配体增殖诱导配体结合能力，同分子对接的结果一致。本发明所述的BCMA-Fc在体内作为欺骗受体可以抑制增殖诱导配体的生物活性，有望成为治疗自身免疫性疾病的特效药物。

本发明的目的通过下述技术方案实现，其包括如下方法和步骤：

1)计算机辅助设计增殖诱导配体阻断剂BCMA-Fc

蛋白质结构数据库PDB数据库下载ID：1XU2和ID：2DTQ，得到BCMA，增殖诱导配体和IgG1Fc结构。使用Biopolymer构建BCMA-Fc融合蛋白，BCMA胞外段与IgG1Fc段之间使用Gla-Ser连接，通过能量优化，得到能量最小化的BCMA-Fc结构，使用superimpose与BCMA胞外段进行比对。IgG1Fc段的融合不干扰BCMA与配体增殖诱导配体结合。

2)BCMA胞外段基因与IgG1Fc段基因融合

3)BCMA-Fc的毕赤酵母表达

本发明所述的BCMA-Fc不限于特定的表达系统，包括真核表达系统与原核表达系统。

4)BCMA-Fc的纯化

毕赤酵母上清，通过Sephacyl S-100凝胶过滤，收集洗脱峰。凝胶过滤洗脱峰上样于rProteinA-Sepharose FF(经0.02M PB(pH 7.0)缓冲液平衡)，离子交换柱用0.02M PB(pH 8.0)洗脱杂蛋白，然后用0.1M Glycine-HCl(pH3.0)缓冲液洗脱，收集洗脱峰。冷冻干燥rProteinA亲和层析洗脱峰收集液，冻干粉于低温保存待用。