[发明专利]一种检测肺炎支原体耐药突变的方法

权利要求书

1.一种检测肺炎支原体耐药突变的方法，其特征在于，采用Real-time PCR及可分辨单碱基差异的cycling探针技术，通过下述步骤：

1)在肺炎支原体23S rRNA基因2063位/2064位碱基上下游序列中寻找针对肺炎支原体的特异性引物，引物序列为：

上游引物5’-CTGAAGCCCCAGTGAACGG-3’

下游引物5’-ATTAGAACAGCACACAACCAAG-3’；

2)根据肺炎支原体无突变敏感株及突变耐药株23S rRNA基因2063位/2064位的碱基差异，分别设计针对无突变敏感株、2063位突变耐药株及2064位突变耐药株的特异性cycling探针；

3)采用肺炎支原体特异性引物进行PCR扩增，通过Real-time PCR扩增仪实时读取荧光强度变化，确定被检样品中的序列的突变类型。

2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2的特异性cycling探针及其序列分别为：

FAM荧光标记的无突变敏感株检测探针：5’-(Eclipse)GACGGAaAGAC(FAM)-3’

HEX荧光标记的2063位突变耐药株探针：5’-(Eclipse)GACGGGaAGAC(HEX)-3’

ROX荧光标记的2064位突变耐药株探针：5’-(Ecl ipse)GACGGAgAGAC(ROX)-3’

其中，粗体小写字母为cycling探针引入的RNA碱基。

3.按权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的不同荧光基团标记的相应探针与PCR扩增产物完全匹配杂交，并被Rnase H切断释放特定荧光，通过Real-time PCR扩增仪实时读取其荧光强度变化。

4.按权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的HEX标记的探针与PCR产物杂交并被Rnase H切断释放HEX荧光，而其它探针不与PCR产物完全匹配杂交，不被Rnase H切断释放荧光，随PCR循环数增加，产物累积致使HEX荧光强度增强，生成HEX荧光强度逐渐上升的扩增曲线，无2063位突变的则维持在水平的基线附近。

5.按权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的FAM标记的探针与PCR产物杂交并被Rnase H切断释放FAM荧光，而其它探针不与PCR产物完全匹配杂交，不被Rnase H切断释放荧光，随PCR循环数增加，产物累积致使FAM荧光强度增强，生成FAM荧光强度逐渐上升的扩增曲线，无突变的则维持在水平的基线附近，

6.按权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的ROX荧光标记的探针与PCR产物杂交并被Rnase H切断释放FAM荧光，而其它探针不与PCR产物完全匹配杂交，不被Rnase H切断释放荧光，随PCR循环数增加，产物累积致使ROX荧光强度增强，生成ROX荧光强度逐渐上升的扩增曲线，无2064位突变的则维持在水平的基线附近。

7.按权利要求1所述的方法，其特征在于，本方法正确区分肺炎支原体临床分离株的无突变敏感株和突变耐药株，特异性为100％，敏感性达10²拷贝/PCR反应。