[发明专利]一种检测肺炎支原体耐药突变的方法

说明书

技术领域

本发明属生物、医药领域，涉及耐药病原微生物检验的方法，具体涉及一种检测肺炎支原体耐药突变的方法。尤其是一种检测肺炎支原体及其大环内酯类耐药突变的方法。

背景技术

肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，Mp)属于柔膜体纲，支原体科，支原体属。由Chanock等于1962年从胸水中首次分离。肺炎支原体可引起支气管炎和非典型肺炎。Foy报道1962～1975年间15％～20％的社区获得性肺炎由肺炎支原体引起(Clin InfectDis.1993，17：S37)，儿童中18％的支原体肺炎需要入院治疗(Clin Microbiol Rev.2004，17：697)。亚洲地区近期进行的一项成人社区获得性肺炎流行病学调查显示，肺炎支原体肺炎约占的12.2％(Int J Infect Dis.2005，9：144)。因此，肺炎支原体是引起社区获得性呼吸道感染的主要和重要病原体之一。

由于肺炎支原体缺乏细胞壁结构，因此对β-内酰胺类、糖肽类和磺胺类等作用于细胞壁的抗生素固有耐药。临床用于治疗肺炎支原体感染的抗菌药物主要包括大环内酯类、四环素类和氟喹诺酮类。四环素类药物因可引起牙齿着色故在妊娠后期、新生儿以及8岁以下儿童中限制使用，氟喹诺酮类可能引起软骨发育异常因此不能应用于儿童。因此，尤其是对于儿童患者而言，大环内酯类药物是治疗肺炎支原体感染的首选药物。

以往认为肺炎支原体对红霉素等大环内酯类敏感性高，无耐药株产生，但近年日本、法国以及中国地区先后报道临床分离到对红霉素等大环内酯类高度耐药的肺炎支原体，给临床治疗，特别是儿童感染者的治疗带来很大挑战。耐药机制研究显示，肺炎支原体23S rRNA发生2063位、2064位或2617位核苷酸的突变是红霉素高耐药的决定因素(Antimicrob Agents Chemother.2004，48：4624；Antimicrob Agents Chemother，2005，49：2302)。近年红霉素耐药肺炎支原体感染发生率逐年上升，上海地区2005～08年肺炎支原体对红霉素耐药率为83％(Antimicrob Agents and Chemother.2009，53：2160)，耐药均由2063位突变所致，北京学者亦有类似报道，发现耐药主要由2063位突变引起，少数由2064位核苷酸突变导致。如能提供以上肺炎支原体耐药突变信息，可为临床医生正确诊断疾病、合理选用抗生素提供客观依据。

基于分离培养的肺炎支原体检测及药敏测定技术，由于肺炎支原体生长缓慢、培养周期长(1～2周)、技术要求高、分离费用昂贵，临床应用困难。因此在临床常规工作中国内外均以血清学方法或聚合酶链反应(PCR)方法进行检测。然而，血清学需比较急性期和恢复期双份血清抗体滴度，只能提供回顾性诊断依据，对临床治疗指导意义不大。PCR方法快速、灵敏，但多数方法只能检测肺炎支原体，而不能检测引起耐药的23S rRNA突变，无法提供药敏方面的信息。目前虽然已有少量检测肺炎支原体耐药突变的PCR检测方法，但由于采用的是限制性酶切片段长度多态性(RFLP，Restriction FragmentLength Polymorphism)、高分辨解链温度分析(HRM，High-Resolution Melt Analysis)等费时、特异性欠佳的PCR产物分析技术，实际应用受到很大限制。

Cycling探针技术是由RNA和DNA构成的杂合探针与Rnase H酶组合使用的高灵敏度检测方法，能够高效率地检出扩增过程中形成的目的基因片段，具体原理如图1所示：Cycling探针是内部含有RNA碱基的嵌合探针(Chimera probe)，探针一端标记荧光物质(Fluorescer)、另一端标记淬灭物质(Quencher)，当探针处于完整状态时，由于荧光淬灭物质作用抑制荧光物质发出荧光。当探针与扩增产物中互补序列杂交(Hybridformation)后，Rnase H酶在RNA碱基处切断探针，淬灭抑制作用解除，荧光物质发出荧光。此时通过测定荧光强度，能够实时监控扩增产物量。如果探针的RNA及邻近碱基与模板不匹配，Rnase H将不能切断探针，所以cycling探针技术是一种单碱基突变的高特异性检测方法，该技术在肺炎支原体耐药突变检测方面尚无报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速、高敏感性、高特异性的检测耐药病原微生物的方法，具体涉及一种检测肺炎支原体耐药突变的方法。尤其是一种检测肺炎支原体及其大环内酯类耐药突变的方法。