[发明专利]一种利用内酯酶制备光学纯2-羟基-4-苯基丁酸的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物化工领域，涉及内酯水解酶用于生产光学纯2-羟基-4-苯基丁酸的方 法。

技术背景

小分子羟基酸，例如乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸和葡萄糖酸等，在其分子结构 中含有羟基以及羧基这两种功能基团，是化学合成中非常有用的中间体，是一类非常重 要的有机酸，在生物体内具有特殊生理功能，而在食品/饲料工业上又是一类非常有用 的功能添加剂。一些非天然的羟基酸，特别是具有光学活性的手性羟基酸，还可以作为 “结构砌块”用于许多天然产物和药物的化学合成。

2-羟基-4-苯基丁酸作为α-羟基酸家族的重要一员，是合成众多“普利”类血管紧 张肽转化酶抑制剂(ACEI)的关键手性中间体。这些酶抑制剂切断肾素-血管紧张素-醛固 酮系统，阻断血管紧张素II的产生而扩张血管、降低血压，是一类安全有效的降压药。 作为合成切块之一，手性羟基-4-苯基丁酸及其乙酯可与不同的氨基部分形成共价键， 合成如依拉普利、赖诺普利等药物。由于手性2-羟基-4-苯基丁酸及其乙酯在该类药物 合成中的重要价值以及原有的专利保护即将过期，吸引了许多研究人员的研究兴趣，并 有多种制备方法被报道。

目前，光学纯2-羟基-4-苯基丁酸的合成主要有3条路线：(1)“经典拆分”，即与 手性胺形成盐，利用化学拆分法将相应的某一对映体酸优先成盐并从溶液中结晶出来而 达到分离的目的(J.Chem.Soc.，Perkin Trans.1，1986，1011)。(2)不对称合成。如分别以D- 苹果酸衍生物或L-丝氨酸为起始原料进行不对称合成。α-乙酰-D-苹果酸酸酐与苯发生 Friedel-Crafts反应，得到(R)-α-乙酰氧基-4-氧代-4-苯基丁酸，经Pd/C还原即得2-羟 基-4-苯基丁酸，ee值100％(Tetrahedron：Asymmetry，2001，12，1583)。但是该方法需用 昂贵的D-苹果酸作为原料，且需要使用到较毒的苯，因而没有实用价值。利用L-丝氨 酸在溴化钾存在下，经亚硝酸钠重氮化得相应的构型保持的溴代酸，然后在氢氧化钠的 作用下脱去溴化氢即得一个R构型的环氧丙酸，再进一步与有机金属试剂在低温下开环 而得2-羟基-4-苯基丁酸。但是，该方法要求在无水和低温下进行，反应条件较苛刻。 (3)不对称催化：包括不对称水解和不对称还原。利用不对称催化氢化，可以由2-羰基-4- 苯基丁酸乙酯经立体选择性的均相或非均相催化氢化制得。其中非均相催化氢化以铂作 为催化剂，三氧化二铝作为载体，用10，11-二氢辛可尼定和甲基醚化的10，11-二氢辛可 尼定等作为修饰剂。利用微生物整细胞或者微生物产生的还原酶不对称还原2-羰基-4- 苯基丁酸(及其乙酯)或者利用水解酶催化水解2-羟基-4-苯基丁酸消旋酯的对映选择 性水解拆分也是一种已知的方法(Adv.Syn.Catal.2008，350，426)，但是一般需要使用大 量的微生物细胞或酶，而且它们的效率都不高。如微生物还原反应，底物/催化剂之比一 般在较低的水平(1/25～1/100g/g湿细胞)。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是建立一种利用内酯水解酶同时生产光学纯2-羟基-4- 苯基丁酸两种对映异构体的新方法，以克服现有技术存在的上述缺陷。

本发明所用的重组内酯水解酶来源于Fusarium proliferatum ECU2002(保藏号为 CGMCC 1494)，是发明人从微生物体内克隆出该酶基因，连接到表达载体pET-28a(+)上 并将其表达到大肠杆菌JM109(DE3)和BL21(DE3)中。该酶的基因序列已登陆在 GenBank上(EU596535)，并在已经公开的专利申请(PCT/CN2007/070598)中有详细的说 明。

本发明的重组内酯水解酶可以用于生产光学纯的2-羟基-4-苯基-丁酸及其衍生物， 重组内酯水解酶的生产方法包括如下的步骤：

(1)重组大肠杆菌的培养

将表达Fusarium proliferatum内酯水解酶基因的重组大肠杆菌采用本领域常规的方 法，在LB培养基中进行扩增培养24～36h，温度20～50℃；

再以上述培养液作为种子，基于发酵培养基体积的接种量为1～10％(v/v)，接种至50 ml的发酵培养基中，在20～50℃下100～160rpm摇床上培养24～48h，离心得到静息细胞；